Analisis Kadar Air AOAC 1984 Analisis Total Fenolik Folin Ciocalteau Shetty et al. 1995 yang

14

C. Metode Analisis

1. Analisis Kadar Air AOAC 1984

Penetapan kadar air merupakan cara untuk mengukur banyaknya air yang terdapat di dalam suatu bahan pangan. Analisis kadar air dilakukan pada sampel buah segar takokak awal dan pada sampel takokak setelah dikering bekukan. Penentuan kadar air ini dilakukan dengan metode pengeringan dengan oven biasa. Prinsip dari metode ini adalah air dikeluarkan dari sampel dengan cara menguapkan air yang terdapat dalam bahan pangan. Persiapan yang perlu dilakukan adalah cawan alumunium yang akan digunakan terlebih dahulu dikeringkan dalam oven pada suhu 100 C selama 15 menit kemudian didinginkan dalam desikator selama 10 menit. Selanjutnya cawan ditimbang dengan menggunakan neraca analitik. Sampel ditimbang sebanyak kurang lebih 2 gram kemudian dikeringkan dalam oven selama kurang lebih 6 jam. Setelah itu, didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Pengeringan sampel kembali ke dalam oven hingga diperoleh berat kering yang relatif konstan tetap. Berikut perhitungan kadar air berdasarkan bb basis basah, yaitu: dimana: W = bobot contoh sebelum dikeringkan g W1 = bobot contoh + cawan sesudah dikeringkan g W2 = bobot cawan kosong g

2. Analisis Total Antosianin

a. Ekstraksi Antosianin Raharja dan Dianawati 2001

Sebanyak ± 1 gram sampel bubuk diekstraksi dengan larutan HCl 5 dalam aquades. Ekstraksi dilakukan dengan merendam bahan didalam wadah botol kaca yang berwarna gelap dengan larutan HCl 5 tersebut 1:10, kemudian campuran disimpan di dalam lemari pendingin bersuhu 4 C selama semalam. Setelah itu campuran tersebut disaring dengan kertas saring Whatman No.1 dengan menggunakan penyaring vakum dan filtrat yang diperoleh dianalisis kandungan antosianinnya dengan metode Less dan Francis 1972.

b. Penentuan Konsentrasi Total Antosianin Less dan Francis 1972 yang

dimodifikasi Sebanyak 0.5 ml filtrat hasil ekstraksi diencerkan hingga 5 ml dengan etanol 95 : HCl 1.5 N 85:15. Filtrat kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 535 nm. Total antosianin dihitung dengan rumus : [ ] Antosianin mg 100 g sampel = Absorbansi x Faktor Pengenceran x 100 98.2 x Wsampel g Kadar air bb = W-W1-W2 x 100 W 15 Faktor 98.2 adal ah nilai ε serapan molar dari pigmen antosianin dalam pelarut etanol 95:HCl 1.5 N 85:15.

3. Analisis Total Asam Askorbat Jacobs 1951 yang dimodifikasi

a. Ekstraksi Sampel

Sebanyak ± 5 gram sampel bubuk dimasukkan dalam labu takar 50 ml dan ditambahkan aquades sampai tera, kemudian disaring dengan penyaing vakum untuk memisahkan filtrat.

b. Pembuatan Larutan Iodium

Larutan iodium 0.01 N dibuat dengan cara mencampurkan 2 gram KI dan 1.269 gram I 2 , kemudian dilarutkan sampai volume 1 liter dengan aquades selama semalam untuk melarutkan iod secara sempurna.

c. Penentuan Konsentrasi Asam Askorbat

Sebanyak 1 ml filtrat hasil ekstraksi diencerkan ke dalam 10 ml air dan diambil 2 ml filtrat hasil pengenceran yang dimasukkan ke dalam erlenmeyer, lalu ditambahkan dengan 0.4 ml larutan amilum soluble starch 1. Larutan kemudian dititrasi dengan 0.01 N iodium. Titik akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan menjadi semburat biru. 1 ml 0.01 N iodium setara dengan 0.88 mg asam askorbat. Konsentrasi asam askorbat dihitung dengan rumus: [ ] vitamin C mg 100 g sampel = titer ml x 0.88 mg x Faktor Pengenceran x 100 Wsampel g

4. Analisis Protein Lowry Waterborg 2002 yang dimodifikasi

a. Ekstraksi

Homogenisasi 100 mg jaringan tumbuhan dengan 1 ml buffer. Sentrifuse sampai homogen pada kecepatan pada kecepatan 12000 g selama 20 menit, kemudian ambil bagian supernatannya. Buffer yang digunakan sama dengan buffer untuk analisis PAL.

b. Pengukuran

Sebanyak 5-200 µl supernatan ditambahkan air sampai dengan 1 ml, lalu tambahkan sebanyak 0.90 ml reagen A dan kocok hingga homogen. Inkubasi larutan selama 10 menit dalam suhu 50 C dan dinginkan sejenak. Sebanyak 0.10 ml reagen B ditambahkan ke dalam larutan tersebut dan dikocok untuk kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Terakhir, larutan ditambahkan dengan 3 ml reagen C dan dikocok serta diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu 50 C. Larutan tersebut lalu diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang λ 650 nm. 16 Perhitungan protein dinyatakan dalam satuan µg per gram, seperti berikut ini: Protein µggram = Protein ekstrak µgml x Volume ekstrak ml x Faktor Pengenceran Bobot contoh g

5. Analisis Aktivitas Phenylalanine Ammonia Lyase PAL Sadasivam dan

Manickam 1996 a. Ekstraksi Enzim Homogenisasi 500 mg bahan sampel plant material dalam 5 ml buffer borat-HCl 25 mM pH 8.8 dingin yang mengandung 5 mM mercaptoethanol 0.4 mLL. Sentrifuse sampai homogen pada kecepatan 12000 g selama 20 menit. Supernatan digunakan sebagai sumber enzim.

b. Penentuan Aktivitas Phenylalanine Ammonia Lyase PAL

Pencampuran 0.5 ml buffer borat, 0.2 ml larutan enzim enzyme solution, dan 1.3 ml air dalam tabung uji. Reaksi dimulai dengan penambahan 1 ml larutan L-Phenylalanine. Inkubasi larutan selama 30-60 menit pada suhu 32 C. Hentikan reaksi dengan menambahkan 0.5 ml Tricholoro Acetic Acid 1 M. Sementara itu, untuk perlakuan kontrol dilakukan dengan menambahkan L-Phenylalanine setelah penambahan Tricholoro Acetic Acid. Pengukuran absorbansi sampel dilakukan pada 290 nm. Larutan standar yang digunakan adalah asam trans-cinnamic.

6. Analisis Kualitatif Fitokimia

Tujuan tahap analisis kualitatif komponen bioaktif fitokimia untuk mengetahui jenis komponen bioaktif sampel ekstrak takokak secara kualitatif sebagai senyawa metabolit sekundernya. Sampel ekstrak yang diuji adalah ekstrak buah takokak metanol PA, etil asetat, dan heksan dan ekstrak hancuran buah takokak metanol PA, etil asetat, dan heksan, sehingga total sampel ada enam jenis.

a. Golongan Alkaloid Houghton dan Raman 1998 yang dimodifikasi

Sebanyak 1 ml ekstrak ditambahkan 10 ml kloroform dan beberapa tetes amoniak, lalu diasamkan dengan beberapa tetes asam sulfat 2 M. Hasilnya akan terbentuk 2 fase, fase asam diambil dan dibagi ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung reaksi pertama ditambahkan 3 tetes pereaksi Dragendorf, tabung kedua ditambahkan 3 tetes pereaksi Mayer, dan tabung ketiga ditambahkan 3 tetes pereaksi Wagner. Hasil uji positif untuk peraksi Dragendorf jika terdapat endapan berwarna jingga. Hasil uji positif dengan pereaksi Mayer jika terdapat endapan berwarna putih. Hasil uji positif dengan pereaksi Wagner jika terdapat endapan berwarna merah kecoklatan. Pembuatan pereaksi Mayer dengan melarutkan 1.36 g HgCl 2 dalam 60 ml air suling. Pada bagian lain dilarutkan pula 5 g KI dalam 10 ml air suling. Kedua larutan ini kemudian dicampurkan dan diencerkan dengan air suling sampai 100 ml. Pereaksi ini disimpan dalam botol berwarna coklat, agar tidak rusak karena cahaya. Pereaksi Dragendorff dibuat dari 8 g KI yang dilarutkan dalam 20 ml air suling, sedangkan pada bagian lain 0.85 g bismuth sub nitrat dilarutkan dalam 10 ml asam asetat 17 glacial dan 40 ml air suling. Kedua larutan dicampurkan. Pereaksi ini disimpan dalam botol berwarna coklat. Untuk penggunaannya satu larutan ini diencerkan dengan 23 bagian larutan 20 ml asam asetat glacial dalam 100 ml air suling. Pereaksi Wagner dibuat dari 1.27 g iodium dan 2 g KI yang dilarutkan dalam 5 ml air suling. Kemudian larutan ini diencerkan menjadi 100 ml dengan air suling. Jika terdapat endapan dilakukan penyaringan dan disimpan dalam botol yang berwarna coklat.

b. Golongan Tanin Harborne 1996

Sebanyak 1 ml ekstrak 2 mg dalam 5 ml etanol ditambahkan 2 tetes larutan FeCl 3 5. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. Kemudian ditambahkan gelatin 1. Jika terdapat endapan putih berarti positif tanin.

c. Golongan Flavonoid Harborne 1996

Sebanyak 1 mg sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform, kemudian sebanyak 1 ml sampel cair ditetesi Pb-asetat. Hasil uji positif untuk flavon bila terbentuk warna jingga atau krem. Kalkon bila terbentuk warna jingga tua dan auron bila terbentuk warna merah.

d. Golongan Terpenoid dan Steroid Uji Lie-Bermann-Burchard Harborne

1996 Sebanyak 1 ml ekstrak dilarutkan dalam 2 ml kloroform, lalu ditambahkan 10 tetes asam asetat glacial dan 3 tetes asam sulfat pekat. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Hasil uji positif terpenoid jika terbentuk warna merah atau ungu. Hasil uji positif steroid jika tebentuk warna merah yang lalu mengalami perubahan warna menjadi biru atau hijau.

e. Golongan Saponin Harborne 1996

Sebanyak 1 ml ekstrak ditambahkan 10 ml air panas lalu didinginkan dan di-vorteks selama 10 detik. Apabila terbentuk buih yang mantap selama sekitar 10 menit, artinya ekstrak mengandung senyawa saponin. Buih yang mantap jika tingginya 1-10 cm dan tidak hilang jika ditambahkan HCl 2N.

7. Analisis Total Fenolik Folin Ciocalteau Shetty et al. 1995 yang

dimodifikasi Analisis total fenol bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa fenol pada sampel. Sampel ekstrak metanol, etil asetat, dan heksan ditimbang sebanyak ±100-200 mg dan dilarutkan dalam etanol PA hingga volume larutannya 2 ml, kemudian vortex selama 2 menit dan larutan inilah yang menjadi larutan stok ekstrak yang dapat disimpan dalam suhu dingin atau freezer. Lalu, larutan tersebut disentrifus pada kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Supernatan ekstrak yang diambil sekitar 12.5-100 µL, sedangkan larutan standar yang diambil sebanyak 0.5 ml dan masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan dengan 0.5 ml etanol 95, 2.5 mL aquades, 18 dan 2.5 ml reagen Folin Ciocalteau 50. Campuran tersebut didiamkan selama 5 menit, lalu ditambahkan 0.5 ml Na 2 CO 3 5 dan divortex. Sampel kemudian disimpan di ruang gelap selama 1 jam. Pengukuran absorbansi sampel dilakukan pada 725 nm dengan larutan standar yang digunakan adalah asam galat dengan variasi konsentrasi 50, 100, 150, 200, dan 250 mgL.

8. Analisis Aktivitas Antioksidan Metode DPPH Andarwulan et al. 2010 yang