25
AJ, neraca kasar Saherand, penangas air Yenaco, flakon, aquarium khusus BSLT, lampu penerang 5 watt Hannochs, dan seperangkat alat destilasi.
3.4 Bahan
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah tinta dari cumi- cumi jenis Photololigo duvaucelii di mana hewan cumi-cumi berasal dari
pusat Pasar Tradisional Sambu Kota Medan. Bahan yang digunakan untuk penyarian yaitu berupa pereaksi n-heksan, etilasetat, dan etanol 96
berkualitas teknis yang telah dimurnikan dengan cara destilasi. Bahan yang digunakan untuk uji BSLT antara lain telur Artemia salina Leach Brine
Shrimp Egg, Ocean Star International Inc, air laut buatan berkadar garam 5 per mil, ekstrak n-Heksan, ekstrak etilasetat, dan ekstrak etanol tinta cumi-
cumi Photololigo duvaucelii, dan suspensi ragi Saccharomyces cerevisae. Bahan kimia yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan berupa aquades
dan garam air laut yang mengandung natrium klorida, magnesium sulfat, magnesium klorida, kalsium klorida, kalium klorida, dan natrium bikarbonat.
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1 Penyiapan sampel
Penyiapan sampel dlakukan secara purposif sengaja yaitu tanpa membandingkan dengan hewan yang sama dari daerah lain yaitu cumi-cumi
jenis Photololigo duvaucelii yang diperoleh dari salah satu kios perikanan di pusat pasar Sambu Kota Medan, provinsi Sumatera Utara.
3.5.2 Identifikasi hewan
Identifikasi hewan cumi-cumi dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan
26
Indonesia Pusat Penelitian Oseanografi di Jakarta. Hasil identifikasi hewan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 46.
3.5.3 Preparasi sampel tinta cumi-cumi
Cumi-cumi segar sebanyak 6 kg diambil kantung tintanya dengan pinset anatomi lalu dibedah untuk mengeluarkan tintanya. Tinta ditampung dalam wadah
beaker glass dan disimpan dalam lemari pendingin sebelum digunakan.
3.5.4 Ekstraksi berkesinambungan tinta cumi-cumi 3.5.4.1 Pembuatan ekstrak n-heksan
Tinta Cumi-cumi diukur volumenya dengan gelas ukur kemudian dimasukkan dalam wadah beaker glass dan diekstraksi dengan pelarut n-heksan
dengan perbandingan 1:3. Tinta diaduk perlahan-lahan bersama pelarut menggunakan batang pengaduk dan disimpan selama 7 hari di dalam lemari
pendingin. Masing-masing ekstrak disaring dengan kertas saring Whatmann No.1 dan dipekatkan pada suhu 40
o
C di atas penangas air. Ekstrak dikumpulkan dan
ditimbang beratnya Girija, 2012. 3.5.4.2 Pembuatan ekstrak etilasetat
Sisa tinta dari ekstraksi pertama dibebaskan dari n-heksan dengan cara dikeringanginkan dengan hair dryer kemudian diukur kembali volumenya dengan
gelas ukur, dimasukkan ke dalam beaker glass dan diekstraksi dengan pelarut etilasetat dengan perbandingan 1:3. Tinta diaduk perlahan-lahan bersama pelarut
menggunakan batang pengaduk dan disimpan dalam lemari pendingin selama 7 hari. Ekstrak disaring dengan kertas saring Whatmann No.1, dipekatkan pada
suhu 40
o
di atas penangas air, dikumpulkan dan ditimbang beratnya Girija, 2012.
27
3.5.4.3 Pembuatan ekstrak etanol
Sisa tinta dari ekstraksi kedua dibebaskan dari etilasetat dengan cara dikeringanginkan dengan hair dryer kemudian diukur kembali volumenya dengan
gelas ukur, dimasukkan ke dalam beaker glass dan diekstraksi dengan pelarut etanol dengan perbandingan 1:3. Tinta diaduk perlahan-lahan bersama pelarut
menggunakan batang pengaduk dan disimpan dalam lemari pendingin selama 7 hari. Ekstrak disaring dengan kertas saring Whatmann No.1 dan dipekatkan pada
suhu 40
o
C di atas penangas air. Ekstrak dikumpulkan dan ditimbang beratnya Girija, 2012.
3.5.5 Uji kualitatif senyawa steroidtriterpenoid
Tinta cumi-cumi ditambah setetes asam asetat anhidrida dengan setetes asam sulfat pekat. Terbentuknya warna biru, hijau, atau merah menandakan
adanya steroid triterpenoid. Ekstrak tinta cumi-cumi diambil cupikannya masing- masing sebanyak tiga tetes untuk diujikan dengan pereaksi lieberman burchard.
3.5.6 Uji toksisitas Brine Shrimp Lethality Test BSLT
3.5.6.1 Pembuatan air laut buatan
Air laut buatan berkadar garam 5 per mil dan pH antara 7,3 - 8,4 merupakan media hidup yang sesuai untuk larva Artemia salina Leach. Bahan
yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan berkadar garam 5 per mil yaitu 10 gram garam air laut yang terdiri dari 5 g natrium klorida, 1,3 g magnesium
sulfat, 1 g magnesium klorida, 0,3 g kalsium klorida, 0,2 g kalium klorida, dan 2 g natrium bikarbonat dicampur dalam 1 liter aquadest. Bahan untuk pembuatan air
laut buatan dapat diracik secara manual atau langsung menggunakan garam air
28
laut yang telah jadi ada tersedia dipasaran. Bahan-bahan tersebut ditimbang lalu dilarutkan dalam sebagian aquadest pada labu takar 1 liter kemudian ditambahkan
aquadest sampai volume tepat 1 liter. Mudjiman, 1989.
Tabel 3.1 Bahan untuk pembuatan air laut buatan
No Bahan
Jumlah g 1.
NaCl 5,0
2. MgSO4
1,3 3.
MgCl2 1,0
4. CaCl2
0,3 5.
KCl 0,2
6. NaHCO3
2,0 7.
Aquadest Sampai 1 liter
3.5.6.2 Penetasan telur
Artemia salina Leach
Tempat penetasan telur artemia berupa aquarium dengan kaca gelap yang terbagi menjadi dua bagian dengan suatu sekat berlubang pada bagian bawahnya.
Salah satu bagian adalah area yang terang, sedangkan bagian lain adalah area yang gelap tempat telur artemia ditaburkan. Suhu penetasan berkisar antara 25
o
C-30
o
C, pH antara 7,3 - 8,4. Air laut buatan dengan kadar garam 5 per mil diaerasi selama
1 jam. Air laut buatan dimasukan dalam aquarium khusus BSLT. Siste artemia ditaburkan di area gelap secara merata dan diberi penerangan., Siste akan menetas
setelah 24 jam menjadi nauplius yang aktif bergerak menuju ke tempat terang. Larva yang akan digunakan adalah larva yang telah berumur 48 jam.
Siste artemia yang telah menetas harus ditambahkan lagi air laut buatan yang telah diaerasi selama 1 jam agar larva artemia yang baru menetas tidak
kekurangan oksigen.
3.5.6.3. Pembuatan larutan A dan B ekstrak n-heksan tinta cumi-cumi
29
Larutan A dengan konsentrasi 10 mgml dibuat dengan menimbang 100,0 mg ekstrak n-heksan tinta cumi-cumi kemudian dilarutkan dalam n-heksan sampai
10,0 ml. Larutan B dengan konsentrasi 1 mgml dibuat dengan mengambil 1,0 ml dari larutan A kemudian dilarutkan dalam n-heksan sampai 10,0 ml.
3.5.6.4 Pembuatan larutan uji sampel ekstrak n-heksan tinta cumi-cumi
Larutan B diencerkan hingga konsentrasi 100 µgml kemudian dibuat seri konsentrasi 10, 18, 32, 58, dan 105 µgml. Adapun cara untuk mendapatkan seri
konsentrasi ekstrak n-heksan yang akan digunakan dalam pengujian dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 51.
Tabel 3.2 Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak n-heksan
Konsentrasi larutan C1
µgml Volume larutan
stok yang diambil V1
ml Volume air laut
buatan yang ditambahkan
V2 ml Konsentrasi
larutan sampel yang diujikan
C2 µgml
100 0,5
0,9 1,6
5 10
5 18
5 32
1000 0,3
0,5 5
58 5
105 3.5.6.5 Pembuatan larutan A dan B ekstrak etilasetat tinta cumi-cumi
Larutan A dengan konsentrasi 10 mgml dibuat dengan menimbang 100,0 mg ekstrak etilasetat tinta cumi-cumi kemudian dilarutkan dalam etilasetat
sampai 10,0 ml. Larutan B dengan konsentrasi 1 mgml dibuat dengan mengambil 1,0 ml dari larutan A kemudian dilarutkan dalam etilasetat sampai
10,0 ml.
3.5.6.6 Pembuatan larutan uji sampel ekstrak etilasetat
30
Larutan B, diencerkan hingga konsentrasi 100 µgml kemudian dibuat seri konsentrasi ekstrak 2; 2,8 ; 3,9 ; 5,5 ; dan 7,7 µgml. Adapun cara untuk
mendapatkan seri konsentrasi ekstrak etilasetat yang akan digunakan dalam pengujian dapat dilihat pada Lampiran 8, halaman 63.
Tabel 3.3 Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak etilasetat
Konsentrasi larutan Stok
C1 µgml
Volume larutan stok yang diambil
V1 ml
Volume air laut buatan yang
ditambahkan V2 ml
Konsentrasi larutan sampel yang diujikan
C2 µgml
100 0,1
5 2
0,14 5
2,8 0,19
5 3,95
0,28 5
5,5 0,39
5 7,7
3.5.6.7 Pembuatan larutan A dan B ekstrak etanol tinta cumi-cumi
Larutan A dengan konsentrasi 10 mgml dibuat dengan menimbang 100,0 mg ekstrak etanol Tinta Cumi-cumi kemudian dilarutkan dalam etanol sampai
10,0 ml. Larutan B dengan konsentrasi 1 mgml dibuat dengan mengambil 1,0 ml dari larutan A kemudian dilarutkan dalam etanol sampai 10,0 ml.
3.5.6.8 Pembuatan larutan uji sampel ekstrak etanol
Larutan B diencerkan hingga konsentrasi 1 dan 10 µgml kemudian dibuat seri konsentrasi 0,1 ; 0,17 ; 0,31 ; 0,55 ; dan 0,98 µgml. konsentrasi tersebut
diperoleh dengan terlebih dahulu membuat serikonsentrasi 0,1; 1 dan 5 µgml kemudian dipilih seri konsentrasi terkecil dan terbesar yang menyebabkan
kematian larva. Seri konsentrasi tersebut dihitung dengan faktor pengali sehingga
31
diperoleh seri konsentrasi pengujian terhadap larva. Adapun cara untuk mendapatkan seri konsentrasi ekstrak etanol yang akan digunakan dalam
pengujian dapat dilihat pada Lampiran 11, halaman 75. Tabel 3.4
Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak etanol Konsentrasi
larutan Stok C1
µgml Volume larutan
stok yang diambil V1
ml Volume air laut
buatan yang ditambahkan V2
ml Konsentrasi larutan
sampel yang diujikan C2
µgml
1 0,5
5 0,1
0,88 5
0,17 0.15
5 0,31
10 0,27
5 0,55
0,49 5
0,98
3.5.6.9 Pelaksanaan uji BSLT
Sepuluh ekor larva Artemia salina Leach yang telah berumur 48 jam diambil, dimasukkan dalam flakon yang berisi sampel dengan konsentrasi tertentu
yang sebelumnya telah dikeringkan, kemudian ditambahkan air laut buatan sebanyak 3 ml. lalu di tambah 1 tetes suspensi ragi 3 mg ragi dalam 5 ml ALB
sebagai makanan dan air laut buatan sampai 5 ml. Setiap pengujian selalu disertai dengan kontrol, yaitu pelarut dengan jumlah yang sama dengan jumlah ekstrak
ditambahkan stiap flakon, kemudian setiap konsentrasi dibuat dalam 5 kali replikasi. Flakon dijaga agar selalu mendapat penerangan. Setelah 24 jam, jumlah
larva yang mati dihitung untuk mengetahui nilai probit dan dianalisis untuk mengetahui harga LC
50
Meyer, dkk., 1982.
32
3.5.7 Analisis data
Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis probit untuk menghitung LC
50
Persentase kematian ditentukan dengan rumus Abbot :
Kematian = x 100
Perhitungan statistik dilakukan dengan menggunakan program statistik SPSS 17.00. Cara perhitungan statistik dapat dilihat pada Lampiran 7, 10, 13 halaman
58, 71, dan 83.
33
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Identifikasi Hewan Cumi-cumi
Hasil identifikasi hewan cumi-cumi yang dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Ancol, Jakarta,
menunjukkan bahwa spesies sampel hewan adalah cumi-cumi jenis Photololigo duvaucelii dOrbigny, 1835, divisi Mollusca, kelas Cephalopoda, bangsa
Myopsida, suku Loliginidae, marga Uroteuthis Photololigo. Hasil identifikasi terlampir pada Lampiran 1, halaman 46.
4.2 Ekstraksi Berkesinambungan Tinta Cumi-cumi
Sampel hewan cumi-cumi sebanyak enam kilogram menghasilkan 46 ml tinta dengan berat ekstrak kasar sebagai berikut:
Tabel 4.1 Hasil ekstraksi berkesinambungan tinta cumi-cumi
Fraksi Warna larutan ekstrak
Berat ekstrak kasar mg Ekstrak n-heksan
Hitam kebiruan 495
Ekstrak etil asetat Kuning Jingga
540 Ekstrak etanol
Hijau kekuningan 948,5
4.3 Uji Kualitatif Senyawa SteroidTriterpenoid
Uji yang banyak digunakan dalam mengidentifikasi steroidtriterpenoid
adalah reaksi Liebermann-Burchard anhidrida asetat-asam sulfat pekat yang
kebanyakan triterpena dan sterol memberikan warna hijau-biru Harborne, 1987.
Hasil uji kualitatif senyawa steroidtriterpenoid dari ekstrak tinta cumi- cumi menunjukkan hasil positif pada ekstrak n-heksan dan etilasetat, namun
menunjukkan hasil yang negatif pada ekstrak etanol. Hal ini diduga kerena pada
