disentrifugasi 12000 rpm selama satu menit. Cairan dibuang, dan Minicolumn dimasukkan kembali ke dalam Collection Tube. Pencucian diulang kembali dengan
menambahkan 500 µ
l Membrane Wash Solution, lalu disentrifugasi 12000 rpm selama lima menit. Minicolumn dipindahkan ke tabung mikro steril, kemudian ditambahkan 50
µ l
ddH
2
O, diinkubasi pada suhu ruang selama satu menit. Hasil elusi disentrifugasi pada 12000 rpm selama satu menit, lalu disimpan pada –20
o
C. Pemurnian hasil PCR dilakukan sama dengan isolasi DNA dari gel, hanya Membrane Binding Solution
ditambahkan dengan volume yang sama dengan volume PCR.
3.3.4 Kloning Gen Patogenisitas
Hasil purifikasi DNA dari Inverse PCR diklon pada vektor pGEM-T Easy. Campuran diligasi dan diinkubasi pada suhu 16
o
C selama semalam. Transformasi dilakukan dengan terlebih dahulu menyiapkan sel kompeten. Sel E. coli DH5
α ditumbuhkan pada media LB pada suhu 37
o
C semalam. Lalu disubkultur dengan memindahkan satu persen kultur E. coli pada medium LB dan diinkubasi selama tiga jam
pada 37
o
C. Sebanyak 1.5 mililiter kultur dimasukkan ke dalam tabung mikro steril, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama dua menit. Pada pelet
ditambahkan satu mililiter NaCl dingin, kemudian diresuspensi dan diinkubasi selama 20 menit di atas es. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama dua menit.
Dua ratus µ
l CaCl
2
-Tris dingin ditambahkan pada pelet dan diresuspensi, lalu diinkubasi selama 30 menit di atas es. Setelah itu sel kompeten siap digunakan untuk transformasi.
Transformasi dilakukan dengan mencampurkan hasil ligasi ke dalam 200 µ
l sel kompeten. Campuran tersebut kemudian diinkubasi di atas es selama 30 menit,
kemudian diinkubasi pada suhu 42
o
C selama 60 detik untuk proses heat –shock. Untuk memulihkan kondisi fisiologi sel, campuran ditambahkan 250
µ l medium LB cair dan
digoyang horisontal pada suhu 37
o
C selama satu jam. Seluruh campuran disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama dua menit. Pada pelet ditambahkan 200
µ l medium
LB cair dan disuspensikan. Suspensi disebar pada medium selektif LA+X-Gal 40 µ
gml dan antibiotika yang sesuai.
Koloni transforman yang tumbuh dan berwarna putih diambil untuk dilakukan verifikasi plasmid. Untuk mengetahui ukuran DNA sisipan pada plasmid transforman,
dilakukan pemotongan plasmid menggunakan enzim EcoRI.
3.3.5 Isolasi DNA Plasmid
Isolasi plasmid dilakukan dengan metode lisis alkalin Sambrook dan Russel 2001. Lima mililiter kultur sel ditumbuhkan semalam, kemudian dipanen dengan
disentrifugasi pada kecepatan 6000 selama dua menit. Pelet disuspensi dengan 200 µ
l 1XTE yang mengandung 50 mM glukosa, kemudian diinkubasi di suhu ruang selama
lima menit. Kemudian ditambahkan 200 µ
l larutan 1SDS dalam 0.2 M NaOH, dan suspensi dibolak balik secara perlahan sampai terjadi lisis yang ditandai dengan
berubahnya larutan menjadi bening dan kental. Sebanyak 200 µ
l larutan Na-asetat pH 4,8 ditambahkan dan di vortex, lalu diinkubasi selama 10 menit. Tabung mikro
disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Supernatan diekstraksi menggunakan fenol+kloroform+isoamilalkohol 25:24:1. Fase cair dipindahkan ke
tabung mikro steril lalu diendapkan dengan 2x volum etanol absolut dingin pada –20
o
C selama 30 menit. Setelah disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit, DNA dicuci
dengan 70 VV etanol dingin dan dikeringudarakan. DNA disuspensi dalam ddH2O dan mengandung 10
µ gml RNAse Sigma Chemical Co., Australia. Setelah diinkubasi
pada suhu 37
o
C selama 30 menit, DNA disimpan pada suhu –20
o
C.
3.3.6 Sekuensing dan Analisis Sekuen DNA
