46
M 1 2 3 4 1 2 3 4
A B
Gambar 25. Elektroforesis gel agarosa terdenaturasi RNA dan analisis hibridisasi RNA Xag YR32 dan Xag M715.
Keterangan : A elektroforegram RNA YR32 dan M715. B hibridisasi RNA YR32
dan M715 dengan probe hasil RT-PCR. A dan B Lajur 1 dan 2 : YR32, lajur 3 dan 4 : M715; lajur M : Marker 1 kb DNA ladder NEB,
USA
4.6 Uji Komplementasi
Uji komplementasi dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya proses pemulihan sifat mutan non patogenik Xag M715 menjadi patogenik kembali jika diintroduksikan gen yang
tersisipi transposon. Pada uji komplementasi ini DNA ukuran 1,3 kb hasil isolasi dengan inverse PCR disisipkan pada plasmid berspektrum luas pRK415 10,5 kb menjadi pRP06
11,8 kb. Konstruksi plasmid pRP06 yang diintroduksikan pada Xag M715 untuk uji komplementasi dapat dilihat pada Gambar 26.
pRP06 diintroduksikan ke Xag M715 dengan cara konjugasi tiga tetua. Hasil verifikasi plasmid pRP06 yang diisolasi dari E. coli DH5
α dan transkonjugan Xag M715 dan dipotong
dengan EcoRI dapat dilihat pada Gambar 27. Berdasarkan Gambar 29, maka dapat dipastikan pRP06 sudah masuk ke dalam Xag M715. Hal ini dibuktikan dengan adanya pita
ukuran 1,3 kb yang berasal dari Xag YR32. Adanya pi ta-pita lain menunjukkan plasmid endogen.
0,6 1,5
2,9
kb kb
47
EcoRI EcoRI
Ligasi
Gambar 26. Konstruksi plasmid pRP06.
48
M 1 M 2
A B Gambar 27. Hasil verifikasi pRP06.
Keterangan : A pRP06 diisolasi dari E. coli DH5
α dan dipotong EcoRI;
B plasmid diisolasi dari transkonjugan Xag M715 dan dipotong EcoRI M : Marker 1 kb DNA ladder NEB, USA
1 : pRP06 dari E. coli DH5 α
dipotong EcoRI 2 : plasmid dari transkonjugan Xag M715 dipotong EcoRI
4.7 Bioesai Kotiledon
Transkonjugan yang membawa pRP06 diinokulasikan pada kotiledon kedelai melalui bioesai untuk mengetahui pengaruhnya terhadap pemulihan sifat patogenisitas Xag M715.
Sebagai kontrol positif digunakan Xag YR32 tipe liar, sebagai kontrol negatif digunakan Xag M715 dan X. campestris pv. campestris . Data hasil pengamatan bioesai kotiledon
dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4. Hasil pengujian patogenisitas dengan bioesai kotiledon
HSI ULANGAN 1
ULANGAN 2 YR32
M715 M715pRP06
Xcc YR32
M715 M715pRP06
Xcc 3
83103 10131
48123 063
117126 13115
43111 075
4
101103 12131
54123 063
125126 20115
54111 075
5
102103 24131
64123 063
126126 29115
88111 075
6 103103
30131 77123
063 126126
25115 95111
075
7 103103
37131 102123
063 126126
30115 103111
075
8 103103
37131 120123
063 126126
30115 109111
075
9 103103
37131 120123
063 126126
30115 110111
075
10 Coklat
37131 120123
063 coklat
30115 110111
075
Rata2 99,7103
28131 82,6123
063 124,6126
24,4115 89111
075
HSI : Hari Setelah Infeksi : perbandingan jumlah kotiledon yang menunjukkan nekrosis terhadap jumlah
kotiledon uji 1.3
1,3 1,0
2,0 3,0
1,0 2,0
3,0
kb
10,5
kb kb
10,5
49
Persentase gejala nekrosis pada kotiledon kedelai yang disebabkan oleh infeksi setiap galur bakteri dapat dilihat pada Tabel 5. Sedangkan diagram gejala nekrosis dapat dilihat
pada Gambar 28. Tabel 5. Persentase gejala nekrosis pada kotiledon kedelai yang diinokulasi dengan strain
Xag
HIS Persentase gejala nekrosis setelah diinfeksi
YR32 M715
M715pRP06 Xcc
3 86,72+8,68
10,19+ 3,62 38,88+ 0,19
4 98,64+0,81
13,28+ 5,82 42,58+ 4,69
5 99,5+0,71
20,02+ 2,43 65,65+ 19,30
6 100,0+ 0
24,49+ 2,25 74,09+ 16,25
7 100,0+ 0
27,16+ 1,53 87,86+ 6,97
8 100,0+ 0
27,16+ 1,53 95,18+ 3,37
9 100,0+ 0
27,16+ 1,53 98,33+ 1,08
HSI : Hari Setelah Infeksi
3 5
7 9
10 20
30 40
50 60
70 80
90 100
Jenis Galur Bakteri
Umur hari
Xcc Xag M715
Xag M715 pRP06 Xag YR32
Gambar 28. Diagram persentase gejala nekrosis pada kotiledon kedelai setelah diinfeksi beberapa galur bakteri.
Keterangan : Xcc : Xanthomonas campestris pv. campestris Xag M715 : Xanthomonas axonopodis pv. glycines M715
Xag M715pRP06 : Xanthomonas axonopodis pv. glycines M715pRP06
Xag YR32 : Xanthomonas axonopodis pv. glycines YR32
50
Berdasarkan data di atas, gejala nekrosis muncul pada hari ke tiga pada kotiledon kedelai yang diinfeksi Xag YR32 dan Xag M715 pRP06. Pada kotiledon kedelai yang
diinfeksi oleh Xag M715 terlihat ada gejala kuning, hal ini disebabkan oleh pelukaan ketika permukaan abaksial kotiledon dilukai jarum sehingga ada sel-sel yang mati. Efek nekrosis
terus bertambah, pada hari ke enam kotiledon yang diinfeksi Xag YR32 100 nekrosis, sementara pada Xag M715pRP06 terus bertambah sampai hari ke sembilan 98,33.
Pada hari ke sepuluh, terjadi pencoklatan pada kotiledon yang diinfeksi Xag YR32 , sementara Xag M715pRP06 efek nekrosis terus menguat tetapi jumlahnya relatif tetap.
Pada Xcc tidak terjadi nekrosis. Gejala nekrosis dapat dilihat pada Gambar 29.
A Gambar 29. Hasil uji komplementasi pada hari ke-3 A
51
B
C Gambar 29. Hasil uji komplementasi hari ke-5 B dan ke-10 C Lanjutan
52
D
E Gambar 29. Hasil uji komplementasi pada hari ke-14 D dan E Lanjutan
53
Pada hari ke 14, kotiledon yang diinfeksi oleh Xag M715pRP06 mengering dan coklat lebih cepat dari pada Xag M715. Hal ini memperkuat bukti bahwa pada Xag M715pRP06
terjadi pemulihan sifat patogenisitas. Pemulihan sifat patogenisitas pada Xag M715pRP06 lebih lambat dibandingkan Xag YR32, hal ini disebabkan gen impX yang dimasukkan ke
dalam M715 melalui pRK415 masih belum lengkap. Untuk mengetahui lebih jelas ada atau tidak ada signifikansi perbedaan antara setiap
perlakuan galur bakteri, maka dilakukan uji statistik dengan Uji Fisher’s Exact pada rata-rata perbandingan jumlah kotiledon yang menunjukkan nekrosis terhadap jumlah kotiledon uji.
Hasil Uji Fisher’s Exact dapat dilihat pada Tabel 6. Tabel 6. Tabel kontingensi efek nekrosis setiap perlakuan galur bakteri
Perlakuan Nilai
P value Xag YR32 vs Xag M715
122126 vs 28131
4.53e-11
Xag YR32 vs Xag M715pRP06 122126 vs 90123 0.159
Xag YR32 vs Xcc 122126 vs 075
5.607e-19
Xag M715 vs Xag M715pRP06 28131 vs 90123
3.369e-7
Xag M715 vs Xcc 28131 vs 075
0.0000145
Xag M715pRP06 vs Xcc 90123 vs 075
3.205e-15 P value dihitung dengan Uji Fisher’s Exact.
Berbeda signifikan P 0.05 ; Uji Fisher’s Exact Hasil Uji Fisher’s Exact menunjukkan bahwa Xag M715 berbeda secara signifikan
dengan Xag M715pRP06. Data ini menginformasikan jumlah kuning nekrosis antara Xag M715 dan Xag M715pRP06 sangat berbeda. Hal ini berarti kuning nekrosis pada Xag
M715pRP06 disebabkan oleh adanya pemulihan sifat patogenisitas atau masuknya gen impX melalui pRK415 ke dalam Xag M715. Informasi ini didukung oleh data yang
menunjukkan bahwa antara Xag YR32 dengan Xag M715pRP06 tidak ada perbedaan. Data ini mengartikan bahwa nekrosis yang disebabkan determinan virulen pada Xag YR32
dengan Xag M715pRP06 sama. Selain itu, jumlah nekrosis yang disebabkan oleh Xag M715 dan Xag M715pRP06 berbeda nyata. Data ini memberi informasi bahwa sifat Xag
M715 dan Xag M715pRP06 sudah berbeda. Hasil bioesai kotiledon sangat mendukung hasil bioinformatika untuk fungsi gen impXA.
Hasil bioinformatika menunjukkan bahwa ImpX adalah suatu putative ABC-ATPase transporter yang mengekspor toksin dan virulen determinan dari patogen ke lingkungannya,
dalam hal ini inangnya. Pada penelitian ini belum membuktikan jenis molekul yang diekspor Xag YR32 ke lingkungannya tetapi fakta hasil bioesai kotiledon sangat mendukung bahwa
molekul yang dikeluarkan merupakan suatu virulen determinan.
54
Pada dasarnya, munculnya nekrosis pada kotiledon kedelai disebabkan oleh adanya faktor-faktor determinan virulen pada galur bakteri yang diujikan. Umumnya, determinan
virulen pada Xanthomonas ini antara lain suatu protease Brunings dan Gabriel 2003. Ekspresi protease diregulasi oleh Quorum Sensing QS. Mekanisme QS pada Xag belum
diketahui, tetapi pada Xanthomonas campestris pv campestris Xcc sudah dipelajari dengan baik. Setelah jumlah bakteri mencapai quorum tertentu, maka konsentrasi feromon
atau autoinduser akan meningkat dan pada Xcc, autoinduser berupa diffusible signal factor DSF yang diekspresikan oleh kluster gen regulation of pathogenicity factors rpf. DSF
merupakan asam cis-11-methyl-2-dodecenoat, suatu α
, β
-asam lemak tak jenuh Wang et al. 2006. DSF akan masuk ke dalam sel patogen sebagai ligan yang akan berinteraksi dengan
reseptor sitoplasma. Konfigurasi protein ini akan menjadi aktivator untuk proses transkripsi gen DSF, termasuk gen-gen lain diantaranya adalah protease tersebut He et al. 2006.
Protease yang diekspresikan akan disekresikan melalui jalur sekresi. Gejala nekrosis pada sel-sel kotiledon kedelai yang diujikan disebabkan oleh masuknya
determinan virulen dari patogen ke dalam sel inang melalui alat transportasi T1SS. Protein ini akan membentuk konfigurasi dengan protein inang dan masuk ke dalam inti sel. Di dalam
inti sel, mode of action dari konfigurasi protein ini sangat tergantung dari genotip tanaman. Pada kasus nekrosis sel-sel kotiledon kedelai, sel mempunyai genotip rr sehingga
konfigurasi protein ini tidak dapat mengaktivkan transkriptom untuk transkripsi gen-gen tertentu Buttner dan Bonas 2002 . Belum diketahui dengan jelas mekanisme dan regulasi
transkripsi pada kasus ini, yang pasti gen-gen ini mengekspresikan protein atau enzim yang terlibat dalam sintesis senyawa metabolit sekunder untuk pertahanan inang terhadap
patogen. Shirasu et al. 1997 menyatakan bahwa asam salisilat merupakan salah satu senyawa yang mengontrol aktivasi mekanisme pertahanan pada tumbuhan dari serangan
patogen. Secara fisiologis dapat dijelaskan bahwa, kondisi metabolisme in vivo pada kotiledon
yang diinfeksi Xag YR32 tidak jauh berbeda dengan metabolisme in vivo kotiledon yang diinfeksi Xag M715pRP06. Pada kotiledon yang diinfeksi Xag YR32, molekul-molekul
virulen determinan dari Xag YR32 masuk dengan baik ke dalam sel inang, sehingga molekul-molekul ini dapat menyebabkan reaksi metabolisme yang luar biasa pada sel inang.
Sel inang tidak dapat mensintesis senyawa antibodi, berupa senyawa metabolit sekunder tertentu sehingga masuknya molekul virulen tersebut dapat mematikan sel inang. Pada
kotiledon yang diinfeksi Xag M715pRP06, terjadi perpindahan molekul-molekul virulen
55
determinan, tetapi arus ke luar nya molekul virulen tidak sesempurna pada Xag YR32. Akibatnya, proses patogenisitas berjalan agak lambat jika dibandingkan dengan Xag YR32.
Pada kotiledon yang diinfeksi Xag M715, hampir tidak ada gejala patogenisitas. Hal ini berarti alat transportasi molekul-molekul virulen determinan tidak bekerja dengan baik atau
bahkan tidak ada, sehingga sebagian besar molekul-molekul virulen determinan tidak dapat masuk ke dalam sel inang.
Jika diperhatikan, berdasarkan hasil bioesai kotiledon Xag M715pRP06 bisa mengembalikan patogenisitas meskipun memerlukan waktu yang lebih lama dari pada Xag
YR32. Fenomena ini dapat dijelaskan bahwa berdasarkan hasil RT-PCR, transkrip impX pada Xag M715 sangat sedikit karena tersisipnya transposon di sekitar gen tersebut
sehingga ImpX pun tidak ada dan tidak terjadi transportasi toksin dan determinan virulen dari patogen ke sel inang. Oleh karena itu tidak ada gejala nekrosis pada kotiledon yang
diinfeksi Xag M715. Pada Xag M715pRP06, materi genetiknya berbeda dengan M715, yaitu terdapat plasmid tambahan pRP06 yang diintroduksikan melalui konjugasi tiga tetua
pada Xag M715. Adanya pRP06 ini tentu saja menambah jumlah transkrip impX dan protein ImpX, dan diduga T1SS pada Xag M715pRP06 lebih banyak jumlahnya dan fungsional
meskipun tidak sesempurna pada Xag YR32. Inilah yang menyebabkan terjadi proses pemulihan sifat patogenisitas pada Xag M715pRP06. Toksin dan determinan virulen dari
Xag M715pRP06 dapat diekspor ke lingkungan sel inang meskipun tidak sesempurna pada Xag YR32. Hal ini yang menyebabkan virulensi dari Xag M715pRP06 lebih rendah
dibandingkan Xag YR32. Ada beberapa sarana transportasi molekul virulen yang terlibat patogenisitas pada
suatu bakteri patogen, seperti T1SS Omori dan Idei 2003, T2SS Johnson et al. 2006, T3SS Mota dan Cornelis 2005, T4SS Li et al. 2005 dan T5SS. Setiap sarana transportasi
akan mentraspor molekul yang spesifik. Kalau diperhatikan lebih jauh, sarana transportasi yang disisipi transposon pada Xag M715 sangat menentukan patogenisitas pustul bakteri,
dalam hal ini protein ABC-ATPase tidak dapat berfungsi artinya protein ini tidak dapat mengekspor molekul-molekul virulen determinan yang sangat penting untuk patogenisitas
pustul bakteri. Bakteri Xag M715pRP06 dapat memulihkan sifat patogenisitas bakteri pustul pada Xag M715, hal ini berarti sarana transportasi yang rusak dapat diperbaiki
dengan masuknya gen dari Xag YR32 pRP06.
56
4.8 Analisis Ekspresi Gen impX
