3.3.14 Isolasi Protein
Satu koloni tunggal E. coli BL21 DE3pLysS ditumbuhkan pada 2 ml medium LB yang ditambah dengan 34
µ gml kloramfenikol. Setelah mencapai OD
600
= 0,7, kultur disentrifugasi 30 detik, lalu dimasukkan ke dalam 50 ml LB. Kultur diinkubasi pada suhu
37
o
C selama tiga jam. Untuk bakteri yang tidak diinduksi, 1,5 ml sel dimasukkan ke dalam tabung mikro steril, lalu disentrifugasi 8.000 rpm selama lima menit. Kemudian,
pelet dicuci dengan 250 µ
l 0,1 mM TrisCl pH 7,5 sebanyak dua kali, lalu disentrifugasi dengan kecepatan yang sama. Pelet diresuspensi dengan 500
µ l 0,1 mM TrisCl pH 7,5.
Untuk sel yang diinduksi, kultur sel ditambah IPTG sampai konsentrasi akhir satu mM IPTG dan diinkubasi selama tiga jam. Setelah itu, 1,5 ml sel dimasukkan ke dalam
tabung mikro steril, lalu disentrifugasi 8.000 rpm selama 5 menit. Pelet dicuci dengan 250
µ l 0,1 mM TrisCl pH 7,5 sebanyak dua kali, kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan yang sama. Pelet disuspensi dengan 500 µ
l 0,1 mM TrisCl pH 7,5. Untuk mengetahui konsentrasi protein total, maka dilakukan uji Bradford. Sel divorteks lalu
supernatannya dimasukkan pada Larutan Bradford. Setelah itu, diukur dengan spektrofotometri pada
λ
595.
Kurva standard kandungan protein dengan persamaan regresi Y= 0,0006X + 0,0353; R
2
= 0,9673.
3.3.15 Elektroforesis Protein dengan SDS-PAGE
Elektroforesis protein dilakukan dengan Mini-Protean Electrophoresis Bio-Rad, USA. Pada elektroforesis ini, digunakan konsentrasi gel penyangga empat persen dan
konsentrasi gel pemisah 10. Ke dalam sumur dimasukkan 13 µ
l protein sampel yang telah dicampur dengan buffer sampel dengan perbandingan 1:4 dan standar bobot
molekul protein LMW Low Molecule Weight Protein, Amersham, England, UK. Elektroforesis dilakukan pada kondisi 100 volt selama 80 menit dalam dingin.
Selanjutnya gel diwarnai dengan 0,025 Coomassie Brilliant Blue selama dua jam, dan dicuci, hingga gel latar belakang jernih kembali. Persamaan regresi standar molekul
LMW, Y=-1,3267X + 5,2925, R
2
=0,9666.
29
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Inverse Polymerase Chain Reaction Inverse PCR
PCR dengan primer P1 : 5’-ATCCTTGCCGCCATTGACCTG-3’ dan P2: 5’- CCACCGAACTTGAACTGGTC-3’ pada kromosom Xag YR32 menunjukkan dua pita yang
berukuran sekitar 1,3 kb dan 3,0 kb Gambar 9. Kemungkinan munculnya lebih dari satu pita sangat besar, tergantung pada probabilitas adanya urutan nukleotida yang sama di
dalam kromosom. M 1
Gambar 9. Elektroforesis gel agarosa DNA produk dari hasil inverse PCR.
Keterangan : M: marker DNA 1 kb DNA ladder, NEB, USA 1 : hasil inverse PCR.
Hasil PCR dipurifikasi dan disisipkan pada pGEM-T Easy 3,015 kb. Transformasi pada E. coli DH 5
α menghasilkan 400 koloni. Verifikasi plasmid dilakukan secara sampling,
yaitu 10 persen dari jumlah total. Verifikasi plasmid dilakukan masing-masing dengan digesti EcoRI, PstI, dan SacI. Hasilnya menunjukkan 61,1 persen sisipan berukuran 1,3 kb, 19,4
persen sisipan berukuran 3,0 kb dan 19,4 persen hanya vektor saja. Hasil verifikasi dengan EcoRI menunjukkan fragmen dengan ukuran 3,0 kb dan 1,3 kb. Verifikasi dengan PstI
menunjukkan ukuran 4,3 kb, sedangkan dengan SacI menunjukkan ukuran 4,3 kb. Berdasarkan hasil verifikasi dengan EcoRI, PstI, dan SacI maka dapat disimpulkan bahwa
ukuran sisipan adalah 1,3 kb pFT3551 dan urutan nukleotida 1,3 kb tidak mempunyai situs EcoRI, PstI, dan SacI. Hasil verifikasi dapat dilihat pada Gambar 10.
1,3 1,5
3,0 1,0
kb kb
Kategori