3.3.5 Isolasi DNA Plasmid
Isolasi plasmid dilakukan dengan metode lisis alkalin Sambrook dan Russel 2001. Lima mililiter kultur sel ditumbuhkan semalam, kemudian dipanen dengan
disentrifugasi pada kecepatan 6000 selama dua menit. Pelet disuspensi dengan 200 µ
l 1XTE yang mengandung 50 mM glukosa, kemudian diinkubasi di suhu ruang selama
lima menit. Kemudian ditambahkan 200 µ
l larutan 1SDS dalam 0.2 M NaOH, dan suspensi dibolak balik secara perlahan sampai terjadi lisis yang ditandai dengan
berubahnya larutan menjadi bening dan kental. Sebanyak 200 µ
l larutan Na-asetat pH 4,8 ditambahkan dan di vortex, lalu diinkubasi selama 10 menit. Tabung mikro
disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Supernatan diekstraksi menggunakan fenol+kloroform+isoamilalkohol 25:24:1. Fase cair dipindahkan ke
tabung mikro steril lalu diendapkan dengan 2x volum etanol absolut dingin pada –20
o
C selama 30 menit. Setelah disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit, DNA dicuci
dengan 70 VV etanol dingin dan dikeringudarakan. DNA disuspensi dalam ddH2O dan mengandung 10
µ gml RNAse Sigma Chemical Co., Australia. Setelah diinkubasi
pada suhu 37
o
C selama 30 menit, DNA disimpan pada suhu –20
o
C.
3.3.6 Sekuensing dan Analisis Sekuen DNA
Sekuensing DNA dilakukan dengan piranti DNA sequencer ABI PRISM 3100- AVANT Genetic Analyzer. DNA sisipan disekuen menggunakan primer universal M13-
Reverse dan M13-Forward . Sekuen DNA yang diperoleh dibandingkan dengan sekuen DNAprotein yang ada di database European Bioinformatics Institute EBI BLASTX 2.0
pada situs http:www.ebi.ac.uk
. Untuk mengetahui fungsi protein yang disandikan oleh gen tersebut dilakukan pelacakan dengan BLAST pada situs
http:www.ncbi.nlm.nih.gov . Analisis ORF juga dilakukan dengan akses
http:www.ncbi.nlm.nih.gov . Analisis promotor dilakukan dengan piranti lunak dari
www.softberry.com . Struktur gen diketahui dengan perunutan sekuen setelah diketahui
kodon awal dan kodon akhir.
3.3.7 Analisis Urutan Asam Amino
Urutan asam amino ImpX dibandingkan dengan database European Bioinformatics Institute EBI SWISS-MODEL REPOSITORY. Urutan asam amino
diperoleh dari hasil pengolahan data bioinformatik dari urutan nukleotida yang diperoleh.
3.3.8 Isolasi RNA dan Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction RT- PCR
RNA total diisolasi dari kultur cair Xag YR32 dan M715 setelah diinkubasi selama 28 jam OD
600
= 0,7. RNA total diisolasi menggunakan Reagent TRIZOL
®
Invitrogen, USA. Kualitas RNA yang terisolasi diverifikasi dengan melarikannya pada gel
elektroforesis gel agarosa 1,5 terdenaturasi. Hasil elektroforesis diwarnai dengan 0,5 µ
M ethidium bromida. RNA dikuantifikasi dengan spektrofotometri pada 260 nm dan 280 nm. Sampel RNA total 5
µ g dilakukan transkriptase terbalik oleh enzim reverse
transcriptase M-MuLV ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit, New England Biolabs, Beverly, USA dengan primer gen spesifik Reverse menggunakan metode
standard dalam volume reaksi 20 µ
l. cDNA diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer imp-forward dan imp-reverse. Perancangan primer menggunakan Netprimer
Analysis Software dari PRIMER Biosoft International. PCR dilakukan pada kondisi praPCR pada suhu 95
o
C selama tiga menit, denaturasi pada suhu 95
o
C selama satu menit, penempelan primer pada suhu 62
o
C selama satu menit, sintesis pada suhu 72
o
C selama satu menit dan postPCR pada suhu 72
o
C selama tujuh menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus. Amplikon dilarikan pada elektroforesis gel agarosa menggunakan
buffer TAE. 16S rDNA diamplifikasi dengan PCR menggunakan universal primer spesifik prokaryot 63F dan 1387R. Amplifikasi 16S rDNA dilakukan pada kondisi prePCR pada
suhu 94
o
C selama lima menit, denaturasi pada suhu 94
o
C selama 30 detik, penempelan pada suhu 55
o
C selama 30 detik, sintesis pada suhu 72
o
C selama satu menit, postPCR pada suhu 72
o
C selama lima menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus.
3.3.9 Analisis Hibridisasi Northern Transfer RNA pada Membran Nilon. Gel yang berisikan RNA total dari Xag
YR32 dan Xag M715 5 µ
g dilarikan menggunakan elektroforesis pada gel agarosa 1 terdenaturasi selama dua jam pada 65V. Gel kemudian diwarnai dengan
µ M ethidium
bromida 0,5 selama 15 menit dan divisualisasi menggunakan UV transilluminator. Gel dicuci dengan DEPC-treated water, lalu direndam dalam 200 ml 0,05 N NaOH selama
10 menit. Gel dipindahkan ke dalam 200 ml 20xSSC 3,0 M NaCl ; 0,3 M Na-asetat pH 7,0 selama 40 menit. Gel segera ditransfer pada membran nilon Amersham Life-
Science, USA semalam pada suhu ruang menggunakan larutan 20xSSC pH7,0 dengan metode kapiler Sambrook dan Russel 2001. Membran dicuci dalam 6xSSC pada suhu
ruang dengan agitasi selama 15 menit, lalu dikeringkan di atas kertas blotting Amersham Life-Science, USA, dilanjutkan dengan fiksasi nukleotida pada membran
dengan menggunakan oven pada suhu 80
o
C selama dua jam.
Pelabelan Pelacak dan Deteksi Hibridisasi. DNA pelacak dilabel dengan
menggunakan NEBlot
TM
Phototope
TM
Kit New England Biolab, Beverly, USA. Sebanyak 5 ng – 1
µ g DNA hasil RT-PCR 375 bp dalam 34
µ l akuabides di dalam tabung mikro,
didenaturasi dalam air dengan pemanasan 100
o
C selama lima menit. Untuk menjaga DNA tetap terdenaturasi, tabung mikro segera disimpan di atas es selama lima menit.
Tabung mikro disentrifugasi pada 5000 rpm selama 30 detik. Selanjutnya secara berturut-turut ke dalam tabung ditambahkan 10
µ l 5x mix labelling, lima
µ l mix dNTP,
dan satu µ
l fragmen Klenow. Tabung reaksi kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama semalam. Reaksi dihentikan dengan menambahkan lima
µ l 0,2 M EDTA pH 8,0.
DNA dipurifikasi dengan NucTrap Probe Purification Column Stratagen, USA. Pada tabung mikro ditambahkan lima
µ l satu persen Tween 20 dan 15
µ l 1 kali bufer STET
0,1 M NaCl; 10 mMTris pH 8,0; satu mM EDTA pH 8,0; 5 Triton X-100. Kolom dibasahi dengan 1x bufer STET sampai jenuh dan dikeluarkan dari kolom dengan
syringe. Sampel dimasukkan ke dalam kolom, lalu dikeluarkan dengan syringe. Untuk mengeluarkan sisa-sisa DNA yang ada di dalam kolom, kolom dicuci dengan 1 kali
buffer STET dengan syringe. DNA yang diperoleh digunakan sebagai pelacak. DNA pelacak disimpan pada suhu -20
o
C sebelum digunakan. Membran diletakkan di dalam tabung hibridisasi, kemudian dimasukkan 10 ml
larutan hibridisasi yang berisi formamide lima mililiter, 50xDenhardts satu mililiter, 20xSSPE 2,5 mililiter, 10 SDS 0,1 mililiter, DEPC-treated water 1,335 ml dan Salmon
sperm DNA Sigma, USA 45 µ
l. Salmon sperm terlebih dahulu dipanaskan pada suhu 95
o
C selama 10 menit, dan disimpan di atas es selama lima menit. Tabung hibridisasi yang berisi membran diinkubasi selama dua jam pada 42
o
C. Pelacak yang telah dilabel dipanaskan dalam air dengan pemanasan pada suhu 100
o
C selama 10 menit, kemudian disimpan di atas es selama lima menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung
hibridisasi, lalu diinkubasi pada suhu 42
o
C selama 16 jam sambil digoyang lemah. Proses hibridisasi dihentikan dengan melakukan pencucian membran menggunakan
Larutan Pencuci I 1 kali SSC, 0,1 SDS sebanyak dua kali masing-masing selama lima menit pada suhu ruang, dan Larutan Pencuci II 0,5 kali SSC, 0,1SDS sebanyak
dua kali masing-masing selama lima menit pada suhu 50
o
C. Pencucian dilakukan dengan agitasi lemah. Membran dikeringudrakan dan siap untuk dideteksi.
Deteksi hasil hibridisasi RNA-DNA dilakukan dengan kit Phototope
TM
Detection Kit New England Biolab, Beverly, USA. Secara berturut-turut membran dicuci dengan
Blocking solution, Larutan Streptavidin, Larutan Pencuci I, Biotinylated Alkaline Phosphatase, Blocking Solution, Larutan Pencuci II, dan Lumigen-PPD Reagent.
Seluruh tahapan ini dilakukan selama lima menit pada suhu ruang dengan goyangan
sedang sesuai protokol kit Phototope
TM
Detection Kit New England Biolab, Beverly, USA. Membran ditempatkan pada kaset X-ray Exposure Holder Eastman Kodak C0,
NY. Selanjutnya dilakukan pemaparan menggunakan film X-ray HyperfilmTM MP, Amersham Life-Science di ruang gelap pada suhu ruang. Film X-ray diproses dengan
cara direndam di dalam larutan high performance X-ray film developer Fuji Photo Film Co., Ltd, Japan sampai pada kontras yang diinginkan. Setelah dibilas dengan air, film X-
ray dimasukkan ke dalam larutan X-ray film fixer Fuji Photo Co., Ltd., Japan. Sesudah dibilas dengan air, film X-ray dikeringudarakan dan sinyal-sinyal yang muncul di film X-
ray diamati.
3.3.10 Uji Komplementasi
Kategori