sedang sesuai protokol kit Phototope
TM
Detection Kit New England Biolab, Beverly, USA. Membran ditempatkan pada kaset X-ray Exposure Holder Eastman Kodak C0,
NY. Selanjutnya dilakukan pemaparan menggunakan film X-ray HyperfilmTM MP, Amersham Life-Science di ruang gelap pada suhu ruang. Film X-ray diproses dengan
cara direndam di dalam larutan high performance X-ray film developer Fuji Photo Film Co., Ltd, Japan sampai pada kontras yang diinginkan. Setelah dibilas dengan air, film X-
ray dimasukkan ke dalam larutan X-ray film fixer Fuji Photo Co., Ltd., Japan. Sesudah dibilas dengan air, film X-ray dikeringudarakan dan sinyal-sinyal yang muncul di film X-
ray diamati.
3.3.10 Uji Komplementasi
Uji komplementasi dilakukan untuk mempelajari ada tidaknya pemulihan patogenisitas pada mutan non-patogenik Xag M715 jika diintroduksi dengan gen imps-cp
dari Xag YR32. Gen imp-cp diklon pada vektor berspektrum luas pRK415, menghasilkan plasmid rekombinan pRP06, kemudian plasmid rekombinan ini diintroduksikan ke Xag
M715 melalui konjugasi tiga tetua, dengan menggunakan E. coli HB101pRK2013 sebagai penolong.
Pemulihan patogenisitas pada Xag mutan M715 pRP06 dibandingkan tingkat patogenisitasnya dengan Xag YR32 tipe liar, mutan Xag M715 melalui bioesai kotiledon
Mesak et al. 1994. Gejala patogenisitas diamati mulai hari ke tiga hingga 14 hari setelah inokulasi.
3.3.11 Konjugasi Tiga Tetua
Resipien Xag M715 ditumbuhkan pada medium Luria Bertani LB yang ditambah 50 µ
gml kanamisin pada suhu 28
o
C selama 16 jam. E. coli HB101 yang membawa plasmid pRK2013 penolong ditumbuhkan pada medium LB yang ditambah 50
µ gml kanamisin
pada suhu 37
o
C selama 16 jam. Donor E. coli pRP06 ditumbuhkan pada medium LB dengan penambahan 15
µ gml tetrasiklin pada suhu 37
o
C selama 16 jam. Perbandingan resipien, penolong dan donor adalah 15:1:1. Sebanyak 1500
µ l sel
resipien, 100 µ
l penolong dan 100 µ
l donor disatukan dalam tabung mikro steril. Lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama dua menit. Pelet dicuci dengan
NaCl 0,85 dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan yang sama. Tahap ini dilakukan tiga kali. Pelet ditambah dengan 25
µ l LB dan diresuspensikan dan di spot
semuanya pada media LB agar. Kultur diinkubasi selama 16 jam pada suhu ruang. Koloni yang tumbuh diambil semuanya dan dipindahkan ke dalam tabung mikro steril
lalu ditambahkan 100 µ
l LB, kemudian divortex sampai homogen. Kultur sel disebar
pada medium LA yang ditambah 50 µ
gml kanamisin, 100 µ
gml rifampisin dan 15 µ
gml tetrasiklin. Kultur diinkubasi pada suhu ruang. Koloni yang tumbuh digores kembali.
Setelah itu dilakukan isolasi plasmid untuk mengecek sisipan yang ada di dalam plasmid.
3.3.12 Bioesai Patogenisitas pada Kotiledon Kedelai
