32
menyandikan Inner membrane protein Imp dengan kemiripan 90 dan Cystein protease Cp dengan kemiripan 99 pada Xac str.306. E-value untuk Imp dan Cp masing-masing
adalah 4e-78 dan 2e-52. Hasil analisis dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Hasil analisis BLASTX.
DB:ID Source
Length Score
Identity Positives
E Q8PIP3 XANAC
Inner membrane protein 439
824 90
92 4e-78
Q8P7B9 XANCP Inner membrane protein
439 744
87 93
1e-69 Q4UWT2 XANC8
Inner membrane protein 439
744 87
93 1e-69
Q9PIP2 XANAC Cystein protease
270 581
99 99
2e-52 Q5H2TO XANOR
Cystein protease 312
542 74
78 2e-48
Q8P7B8 XANCP Cystein protease
241 519
85 92
6e-46
Untuk lebih meyakinkan, maka dilakukan juga analisis FASTX dan hasilnya menunjukkan bahwa fragmen ukuran 1,3 kb Xag YR32 menyandikan Imp dengan kemiripan
90,8 dan Cp dengan kemiripan 99 pada Xac str 306. E-value untuk Imp dan Cp masing- masing adalah 7,4e-48 dan 1,1e-31. Hasil analisis dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil analisis FASTX.
DB:ID Source
Length Identity
Ungapped Overlap
E Q8PIP3 XANAC
Inner membrane protein 439
90,860 92,857
186 7,4e-48
Q4UWT2 XANC8 Inner membrane protein
439 87,349
87,349 166
1,4e-42 Q8P7B9 XANCP
Inner membrane protein 439
87,349 87,349
166 1,4e-42
Q8PIP2 XANAC Cystein protease
270 91,129
91,129 124
1,1e-31 Q5H2TO XANOR
Cystein protease 312
69,697 69,697
165 1,1e-29
Q4UWT3 XANC8 Cystein protease
241 79,839
79,839 124
5,4e-28
Hasil BLASTX dan FASTX menunjukkan kecenderungan yang sama, kedua hasil program ini memperlihatkan bahwa nukleotida1,3 kb menyandikan Imp dan Cp.
4.3 Analisis Struktur Gen
Hasil BLASTX dan FASTX memberikan informasi bahwa urutan nukleotida yang diperoleh mengekspresikan protein Imp dan Cp. Untuk mengetahui lebih lanjut tentang
kedua gen ini, maka dilakukan analisis open reading frame finder ORF Finder. Analisis ORF menggunakan situs
http:www.ncbi.nlm.nih.govorf yang akan memberi informasi ada
33
tidaknya kodon awal ATG dan kodon akhir TAATAGTGA. Hasil analisis menunjukkan bahwa ada dua ORF pada urutan nukleotida 1,3 kb Gambar 14 dan 15.
Gambar 14. Hasil analisis open reading frame ORF untuk inner membrane protein imp. Analisis ORF di atas menginformasikan bahwa ada satu ORF dari urutan nukleotida
satu sampai dengan 525. Urutan tersebut membawa kodon awal ATG pada posisi 525 tetapi belum ada kodon akhir, hal ini berarti, ORF tersebut belum lengkap. ORF mempunyai
174 asam amino. Setelah dilakukan BLASTP,ORF ini diduga mengekspresikan protein CreD.
Analisis ORF yang lain menunjukkan bahwa ada satu ORF dari urutan nukleotida 831 sampai dengan 1292. Urutan tersebut membawa kodon awal ATG pada posisi 831 dan
kodon akhir TAG pada posisi 1292. ORF mempunyai 153 asam amino. Hasil BLASTP memberi informasi bahwa ORF ini mengekspresikan suatu peptidase, yaitu cystein
protease. Berdasarkan hasil analisis ORF Finder, maka nukleotida ukuran 1,3 kb menyandikan
dua protein yaitu Imp dan Cp. Kedua ORF ini tidak pada operon yang sama, ditandai dengan adanya kodon awal dengan posisi yang berlawanan.
34
Gambar 15. Hasil analisis open reading frame ORF untuk Cystein Protease Cp. Data menunjukkan bahwa ada dua ORF dengan arah operon yang berbeda, oleh
karena itu perlu diketahui ribosom binding site RBS atau Shine Delgarno, dan promoter untuk masing-masing operon Tang et al. 1991, Katzen et al. 1996, Baldini et al. 1999.
Berdasarkan analisis promotor, ternyata arah transkripsi ke dua gen ini berlawanan. Hasil analisis struktur gen dapat dilihat pada Gambar 16.
Selain itu dilakukan juga analisis restriksi pada kedua operon. Situs restriksi perlu diketahui untuk kepentingan kloning lainnya, seperti Gene Knock out, ekspresi gen, IPCR
dan lainnya. Hasil analisis dapat dilihat pada Gambar 17. Pada Gambar tersebut, dapat diketahui bahwa tidak ada situs EcoRI, PstI dan SacI seperti yang dilakukan pada verifikasi
plasmid pFT3551 Gambar 10.
35
Gambar 16. Struktur gen pada fragmen 1,3 kb dari Xanthomonas axonopodis pv glycines YR32.
36
Gambar 17. Posisi situs restriksi pada fragmen 1,3 kb Xag YR32. Penelitian ini merupakan lanjutan dari penelitian sebelumnya yang dilakukan Pratiwi
2004, maka dari itu, perlu penggabungan sekuen dengan yang diperoleh. Pertemuan sekuen ada pada urutan 5’-ACGCCGCGCTTGCAGGTCAATGGCGGCAAGGAT-3’ pada
gen imp. Berdasarkan hal ini, maka diduga kodon akhir ada pada sekuen Pratiwi 2004. Setelah dilakukan penggabungan, lalu dilakukan analisis ORF. Hasil analisis ORF
menunjukkan bahwa kodon akhir adalah TGA. Analisis dilanjutkan dengan BLASTP, dan hasil menunjukkan bahwa gen menyandikan CreD, suatu Imp Gambar 18. Hasil
penggabungan sekuen, menghasilkan ORF yang utuh, mempunyai kodon awal ATG dan akhir TGA. Preferensi kodon akhir TGA pada Xac str. 306 paling tinggi, yaitu 70,89
http:rice.tigr.orgtigr_scriptsCMR2codon_tables . Deduksi asam amino dari ORF tersebut
adalah 182 asam amino. Selanjutnya, gen imp pada Xag YR32 disebut impX.
Gambar 18. Hasil analisis open reading frame ORF sekuen inner membrane protein imp yang telah digabungkan.
37
Berdasarkan penelusuran data GenBank, panjang ORF imp pada Xanthomonas berbeda-beda. Xanthomonas axonopodis pv citri str 306 Xac str 306 1300 nukleotida,
Xanthomonas campestris pv campestris 8004 Xcc 1320 nukleotida, Xanthomonas oryzae pv oryzae Xoo 10331 573 nukleotida, sedangkan Xag YR32 546 nukleotida. Hasil
ClustalW memberi informasi bahwa Xag YR32 dan Xac str 306 mempunyai score 91, Xag YR32 dan Xcc score 79, Xag YR32 dan Xoo score 45. Berdasarkan penyejajaran nukleotida
tersebut, maka Xag YR32 sangat dekat dengan Xac str 306, tetapi nukleotida Xag YR32 jauh lebih pendek. Hal ini merupakan keunikan dari impX Xag YR32. Data didukung oleh
hasil hibridisasi Northern dijelaskan kemudian, bahwa impX merupakan gen monosistronik dengan ukuran gen sekitar 546 bp.
Analisis dilanjutkan dengan analisis penentuan RBS, promotor, dan terminator untuk impX. Struktur gen dapat dilihat pada Gambar 19. Posisi penyisipan transposon diketahui
berdasarkan data sebelumnya Pratiwi 2004. Transposon menyisip pada posisi 500 dari sekuen Pratiwi 2004, setelah disesuaikan dengan urutan nukleotida maka diketahui posisi
penyisipan transposon pada gen impX. Bagan penyisipan transposon dapat dilihat pada Gambar 20. Transposon menyisip pada bagian C -terminal gen impX.
38
acagtggcggtcgtcgaataaccgg
-35
gtcgcgcacttcaccttcgcttcaaat tcgcctcaaacctgcgac
-10 accggcgcagcgcaccctggccacctcccaagatgaggatggccg
rbs atgaaatccctgaaactgttattgcggttcgccaccatcggtggg
M K S L K L L L R F A T I G G start
ctgatcctgctgttgctgattccgctgctcctgatccgtggcgcg L I L L L L I P L L L I R G A
gtgcaggaccgcgcgcgctaccgcgacgaggcggtggagcgggtg
V Q D R A R Y R D E A V E R V gcgcagagcaaggctggcgagcagcagttcatcgcgccggtgcgg
A Q S K A G E Q Q F I A P V R gtactgccgtataccgaagacgtgcaggtcaccgagccggacgag
V L P Y T E D V Q V T E P D E cagggcaaccagcgcaaggtccggcgcaagcgcgaagggacgctg
Q G N Q R K V R R K R E G T L ctgcaaacgccgcgtcgcctgaaactcagcggcgaaatggtgccc
L Q T P R R L K L S G E M V P tcggtgcgcgaggtgggcttgtaccgggtgcaggtgtattcctgg
S V R E V G L Y R V Q V Y S W aaagccaccttgcatgccgaatacgactccttcgactacgcggct
K A T L H A E Y D S F D Y A A gcgccgacccgtgcgtatggccagccgtacctggcaatcggtatg
A P T R A Y G Q P Y L A I G M tccgacgtgcgcgggttggtgggcacgccgcgcttgcaggtcaat
S D V R G L V G T P R L Q V N ggcggcaaggatcgggtgcgcttccagagcgctatcgaacgcttt
G G K D R V R F Q S A I E R F cgaaagtgactgttgacacgactctta gag accataagaatcaac
R K
putative terminator putative terminator
Stop tccactgaattggtactttccagtcagggccgttgatcagcaatg
Gambar 19. Urutan DNA dari struktur gen impX dan asam amino yang dideduksi dari impX serta posisi penyisipan transposon anak panah.
Keterangan : -35,-10:putative promoter, rbs: putative ribosome binding site; start: putative kodon awal ATG; stop: putative kodon akhir TGA.
39
2198 bp Gambar 20. Peta fisik gen imp, cp dan tonB-dependent receptor
Keterangan : ORF1 : cystein protease ORF2 : inner membrane protein X impX
ORF3 : tonB-dependent receptor
4.4 Analisis Fungsi ImpX
