pada medium LA yang ditambah 50 µ
gml kanamisin, 100 µ
gml rifampisin dan 15 µ
gml tetrasiklin. Kultur diinkubasi pada suhu ruang. Koloni yang tumbuh digores kembali.
Setelah itu dilakukan isolasi plasmid untuk mengecek sisipan yang ada di dalam plasmid.
3.3.12 Bioesai Patogenisitas pada Kotiledon Kedelai
Bioesai patogenisitas pustul bakteri menggunakan benih kedelai varietas Wilis yang diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Sumberdaya Genetik BB-Biogen, Bogor. Biji kedelai didesinfeksi dengan NaOCl 0,5, lalu digulung di dalam kertas merang dan diletakkan pada wadah berpenyangga berisi
air, sehingga air meresap dan membasahi seluruh kertas merang. Kotiledon digunakan setelah berumur tujuh hari. Selanjutnya kotiledon dipisahkan dari tanaman dengan silet
bersih dan steril lalu didesinfeksi dengan NaOCl 0,5 selama lima menit dan dibilas dengan akuades steril tiga kali untuk membersihkan sisa-sisa NaOCl. Bagian abaksial
kotiledon ditusuk dengan seperangkat lima jarum steril yang diikat menjadi satu Mesak et al. 1994. Koloni bakteri dari biakan umur 48 jam yang akan diuji dioleskan pada
bekas luka tusukan pada kotiledon. Bakteri yang diuji adalah Xag YR32 tipe liar, Xag M715, Xag M715pRP06, dan X. campestris campestris kontrol negatif. Inkubasi
dilakukan dalam ruang tumbuh bercahaya selama 3-14 hari pada suhu ruang. Parameter yang diamati adalah munculnya bercak kuning pada ktiledon.
3.3.13 Kloning dan Ekspresi Gen impX
Untuk mendapatkan gen impX, kromosom Xag YR32 tipe liar diamplifikasi menggunakan PCR dengan primer A : 5’-GGGGGACATATGAAATCCCTGAAAGTG-3’
dan B : 5’-GGGGGATCCAAACCGCGGGAATTCGAT-3’. Huruf yang digarisbawahi masing-masing menunjukkan situs restriksi NdeI dan BamHI. Primer dirancang dari
urutan nukleotida yang berhasil diisolasi dari Xag YR32. PCR dilakukan pada kondisi prePCR 94
o
C selama satu menit, denaturasi 95
o
C selama dua menit, penempelan primer 60
o
C selama satu menit, sintesis 72
o
C selama satu menit dan postPCR 72
o
C selama 10 menit. Siklus PCR sebanyak 30 siklus. Hasil PCR dipurifikasi dengan
WizardR SV Gel and PCR Clean-UP System Promega, USA lalu diligasi dengan pGEM-T Easy. Plasmid rekombinan ditransformasikan pada E. coli DH5
α .
Plasmid rekombinan dalam E. coli DH 5 α
diisolasi dengan dipotong NdeI dan BamHI, lalu sisipan yang berukuran 519 bp diligasikan dengan pET15b yang
sebelumnya telah dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Plasmid rekombinan pada pET15b ditransformasikan pada E. coli BL21 DE3pLysS.
3.3.14 Isolasi Protein
