29
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Inverse Polymerase Chain Reaction Inverse PCR
PCR dengan primer P1 : 5’-ATCCTTGCCGCCATTGACCTG-3’ dan P2: 5’- CCACCGAACTTGAACTGGTC-3’ pada kromosom Xag YR32 menunjukkan dua pita yang
berukuran sekitar 1,3 kb dan 3,0 kb Gambar 9. Kemungkinan munculnya lebih dari satu pita sangat besar, tergantung pada probabilitas adanya urutan nukleotida yang sama di
dalam kromosom. M 1
Gambar 9. Elektroforesis gel agarosa DNA produk dari hasil inverse PCR.
Keterangan : M: marker DNA 1 kb DNA ladder, NEB, USA 1 : hasil inverse PCR.
Hasil PCR dipurifikasi dan disisipkan pada pGEM-T Easy 3,015 kb. Transformasi pada E. coli DH 5
α menghasilkan 400 koloni. Verifikasi plasmid dilakukan secara sampling,
yaitu 10 persen dari jumlah total. Verifikasi plasmid dilakukan masing-masing dengan digesti EcoRI, PstI, dan SacI. Hasilnya menunjukkan 61,1 persen sisipan berukuran 1,3 kb, 19,4
persen sisipan berukuran 3,0 kb dan 19,4 persen hanya vektor saja. Hasil verifikasi dengan EcoRI menunjukkan fragmen dengan ukuran 3,0 kb dan 1,3 kb. Verifikasi dengan PstI
menunjukkan ukuran 4,3 kb, sedangkan dengan SacI menunjukkan ukuran 4,3 kb. Berdasarkan hasil verifikasi dengan EcoRI, PstI, dan SacI maka dapat disimpulkan bahwa
ukuran sisipan adalah 1,3 kb pFT3551 dan urutan nukleotida 1,3 kb tidak mempunyai situs EcoRI, PstI, dan SacI. Hasil verifikasi dapat dilihat pada Gambar 10.
1,3 1,5
3,0 1,0
kb kb
30
M 1 2 3
Gambar 10. Elektroforesis gel agarosa DNA hasil verifikasi pFT3551.
Keterangan : M= Marker DNA 1 kb DNA ladder, NEB, USA, 1=pFT3551 -EcoRI, 2=pFT3551-PstI, 3=pFT3551 -SacI.
Hasil inverse PCR yang berukuran 1,3 kb disisipkan pada pGEM-T Easy dan plasmid rekombinannya dinamai pFT3551 seperti dapat dilihat pada Gambar 11.
Gambar 11. Plasmid rekombinan pFT3551.
4.2 Analisis Urutan DNA
Fragmen ukuran 1,3 kb dan 3,0 kb disisipkan pada pGEM-T Easy, disekuen untuk mengetahui urutan nukleotidanya. Urutan nukleotida dianalisis penyejajarannya dengan
sekuen Pratiwi 2004. Sekuen 1,3 kb mempunyai 33 nukleotida yang sama dengan sekuen
4,3 3,0
1,3 3,0
1,5
kb kb
31
asal sedangkan 3,0 kb hanya primer saja. Berdasarkan data di atas, maka salah satu flanking DNA yang tersisipi transposon adalah sekuen 1,3 kb. Oleh karena itu, analisis
dilakukan lebih lanjut pada sekuen 1,3 kb. Fragmen yang berukuran 1,3 kb yang disisipkan pada pGEM-T Easy, disekuen untuk
mengetahui urutan nukleotidanya. Urutan nukleotida yang diperoleh dianalisis dengan BLAST Altschul et al. 1997 untuk mengetahui kemiripan urutan nukleotida yang diperoleh
dengan database. Hasil penyejajaran dengan database menunjukkan bahwa urutan nukleotida yang diperoleh dari Xag pv glycines YR32 sangat mirip dengan Xanthomonas
axonopodis pv. citri str.306 Xac. Hasil BLASTN dan penyejajarannya dapat dilihat pada Gambar 12 dan Gambar 13.
Score E Value Bits
Gambar 12. Hasil analisis BLASTN.
Gambar 13. Hasil penyejajaran urutan nukleotida ukuran 1,3 kb Xag dengan Xac. Score : 2430, Expect : 0,0 ,Identities : 12441250 90, Gaps : 0.
Berdasarkan hasil analisis BLASTN, Xag YR32 mirip dengan Xac str. 306 dengan nilai score sangat tinggi, yaitu 2430. Selain itu, E-value menunjukkan angka nol, hal ini berarti
kemiripan sekuen DNA antara keduanya sangat ajeg reliable. Hasil penyejajaran alignment menunjukkan bahwa Xag YR32 dengan Xac str.306 mempunyai kesamaan
identity 99. Untuk mengetahui fungsi dari urutan nukleotida tersebut, maka dilakukan analisis
menggunakan program BLASTX BLOSUM62. Fragmen ukuran 1,3 kb Xag YR32
32
menyandikan Inner membrane protein Imp dengan kemiripan 90 dan Cystein protease Cp dengan kemiripan 99 pada Xac str.306. E-value untuk Imp dan Cp masing-masing
adalah 4e-78 dan 2e-52. Hasil analisis dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Hasil analisis BLASTX.
DB:ID Source
Length Score
Identity Positives
E Q8PIP3 XANAC
Inner membrane protein 439
824 90
92 4e-78
Q8P7B9 XANCP Inner membrane protein
439 744
87 93
1e-69 Q4UWT2 XANC8
Inner membrane protein 439
744 87
93 1e-69
Q9PIP2 XANAC Cystein protease
270 581
99 99
2e-52 Q5H2TO XANOR
Cystein protease 312
542 74
78 2e-48
Q8P7B8 XANCP Cystein protease
241 519
85 92
6e-46
Untuk lebih meyakinkan, maka dilakukan juga analisis FASTX dan hasilnya menunjukkan bahwa fragmen ukuran 1,3 kb Xag YR32 menyandikan Imp dengan kemiripan
90,8 dan Cp dengan kemiripan 99 pada Xac str 306. E-value untuk Imp dan Cp masing- masing adalah 7,4e-48 dan 1,1e-31. Hasil analisis dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil analisis FASTX.
DB:ID Source
Length Identity
Ungapped Overlap
E Q8PIP3 XANAC
Inner membrane protein 439
90,860 92,857
186 7,4e-48
Q4UWT2 XANC8 Inner membrane protein
439 87,349
87,349 166
1,4e-42 Q8P7B9 XANCP
Inner membrane protein 439
87,349 87,349
166 1,4e-42
Q8PIP2 XANAC Cystein protease
270 91,129
91,129 124
1,1e-31 Q5H2TO XANOR
Cystein protease 312
69,697 69,697
165 1,1e-29
Q4UWT3 XANC8 Cystein protease
241 79,839
79,839 124
5,4e-28
Hasil BLASTX dan FASTX menunjukkan kecenderungan yang sama, kedua hasil program ini memperlihatkan bahwa nukleotida1,3 kb menyandikan Imp dan Cp.
4.3 Analisis Struktur Gen
Kategori