56
4.8 Analisis Ekspresi Gen impX
Gen impX menyandikan protein putative ABC-ATPase, suatu protein membran. Untuk membuktikan bahwa gen ini diekspresikan maka dilakukan kloning gen impX pada plasmid
overekspresi sehingga diharapkan gen ditranskripsi dan ditranslasi menjadi suatu protein heterologous.
Strategi kloning impX dapat dilihat pada Gambar 30. Hasil PCR impX 519 bp dengan primer A dan B dapat dilihat pada Gambar 31 A. pET15b Novagen merupakan plasmid
fusi translasi. Gen impX tersisip pada pET15b melalui NdeI dan BamHI. Hasil verifikasi pemotongan pEG01 yang diisolasi dari E. coli BL21 DE3 pLysS dengan NdeI dan BamHI
dapat dilihat pada Gambar 31 B. Plasmid pEG01 ditransformasikan ke dalam sel E. coli BL21 DE3 pLysS dan di
kultur dengan perlakukan induksi dan tidak induksi IPTG. Setelah dilakukan isolasi protein total dan penghitungan konsentrasi protein total dari sel yang diinduksi dan tidak diinduksi.
Protein total dilarikan pada SDS-PAGE. Ukuran protein Imp sekitar 16,11 kD, tidak jauh dari hasil penghitungan bobot molekul Imp dengan
http:ca.expasy.orgcgi-bin , yaitu sekitar
20,99 kD. Hasil SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 32. Hasil SDS-PAGE menunjukkan indikasi awal bahwa gen impX diekspresikan pada E. coli BL21 DE3 pLysS, dan pada sel
diinduksi IPTG 1 mM terjadi ekspresi berlebih. Konsentrasi protein total sama untuk kedua macam sel, yaitu 111,4166
ยต gml.
57
Ligasi
NdeI + BamHI NdeI + BamHI
Ligasi
Gambar 30. Konstruksi plasmid pEG01 untuk ekspresi protein heterologous
58
1 M M 1
A B Gambar 31. Verifikasi hasil PCR impX dan verifikasi plasmid pEG01 dengan NdeI dan
BamHI.
Keterangan : A. Hasil PCR gen imps 0,519 kb 1; B verifikasi plasmid pEG01
dengan NdeI dan BamHI 0,519 kb dan 5,708 kb 1; A dan B M: marker 1kb ladder NEB, USA.
M 1 2
Gambar 32. Hasil SDS-PAGE protein total.
Keterangan : M : Marker bobot molekul protein LMW Amersham, USA,
1: sel diinduksi dengan IPTG 1 mM, 2: sel tidak diinduksi dengan IPTG 1 mM
0,519 0,519
5,708
16,11 14,4
20,1 0,5
3,0
30,0 66,0
kb kb
kb
kDa kDa
59
4.9 Implikasi Hasil Penelitian dengan Penelitian Sebelumnya
Kategori