39
2198 bp Gambar 20. Peta fisik gen imp, cp dan tonB-dependent receptor
Keterangan : ORF1 : cystein protease ORF2 : inner membrane protein X impX
ORF3 : tonB-dependent receptor
4.4 Analisis Fungsi ImpX
Hasil BLASTX menggambarkan bahwa gen yang tersisipi transposon pada kromosom Xag M715 diduga adalah gen impX. Jika ditelusuri lebih jauh, maka gen impX ini termasuk
pfam CreD Marchler-Bauer dan Bryant 2004. Inner membrane protein CreD merupakan famili protein yang terdiri atas beberapa CreD yang terdapat pada bakteri atau disebut juga
Cet inner membrane protein. Mutasi dominan gen cet pada E. coli menyebabkan bakteri ini toleran terhadap colicin E2. Colicin merupakan salah satu bakteriosin yaitu senyawa
antibakteri atau antibiotik yang dapat mematikan bakteri pada spesies yang berdekatan atau strain yang berbeda tapi spesies yang sama Madigan et al. 2003. Parker dan Feil 2004
menyatakan bahwa ketika terjadi induksi, colicin diekspresikan dalam jumlah banyak dan disekresikan ke medium ekstraseluler dengan bantuan protein yang dikode plasmid Sel
yang mempunyai plasmid dilindungi dari serangan colicinnya sendiri dengan adanya protein immunity yang dikode oleh plasmid yang sama. Molekul colicin yang disekresikan terikat
pada protein reseptor pada membran luar sel target lalu ditranspor melintasi membran luar menuju periplasmik sel target menggunakan sistem transpor bakteri, Tol atau Ton. Colicin
dapat menyebabkan kematian sel melalui beberapa proses termasuk perusakan membran sitoplasma dengan terbentuknya pori atau masuk ke dalam sitoplasma menghambat
sintesis protein atau berperan sebagai suatu DNAse atau RNAse. Untuk lebih meyakinkan hasil di atas, maka dilakukan lagi analisis fungsi protein
ImpX dengan melakukan perbandingan urutan asam amino ImpX dengan database. Urutan
miniTn5 -Km
R
-Tp
R
40
asam amino ImpX yang diperoleh relatif pendek, sehingga dicari alternatif lain yang memungkinkan.
Metode yang dipakai, yaitu melalui Model Navigator dari http:swissmodel.expasy.orgrepository
. Model Navigator yang dipakai adalah Inner Membrane Protein X. campestris pv. campes tris yang sudah ada di database. Alasannya,
berdasarkan hasil BLASTN Xcc mempunyai score 291 dan E-value 2e-77 terhadap Xag YR32. Selain itu, hasil penyejajaran DNA Imp Xcc dan Xag YR32 dengan ClustalW
menunjukkan score 79. Data-data di atas menggambarkan kedekatan hubungan Imp Xcc dengan ImpX. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa Imp Xcc merupakan domain dari
Secretion protein HlyD, identity 52,6, E-value 4,2E-32. Omori dan Idei 2003 menjelas kan bahwa Hly merupakan salah satu sistem ATP Binding Cassette ABC exporter yang terlibat
dalam transpor hemolysin pada E. coli. Ada tiga protein, yaitu HlyB sebagai ABC protein, HlyD sebagai membrane fusion protein MFP di periplasmik, dan protein membran luar
TolC. Data di atas memberi keterangan yang lebih jelas tentang fungsi dari ImpX.
Berdasarkan karakter-karakter yang dimiliki ABC transporter, maka ImpX memenuhi beberapa kriteria sebagai ABC transporter yaitu N-terminal hidrofobik, mempunyai signal
peptida, mempunyai transmembrane region, C-terminal mempunyai Walker Motif A GXXGKT, signature motif, dan Walker Motif B KXHD yang hidrofilik Gambar 21. Walker
Motif A adalah situs tempat menempelnya α
dan β
fosfat dari ATP, sedangkan Walker Motif B adalah tempat menempelnya ion Mg , signature motif sebagai situs hidrolisis Pearson et
al. 2004. ImpX mempunyai N-terminal hidrofobik sebagai domain putative transmembrane
region. Putative transmembrane region menunjukkan prediksi lokasi heliks transmembran dan prediksi lokasi intervening loop regions. Berdasarkan analisis bioinformatika pada ImpX,
dengan panjang asam amino 182 terdapat satu transmembran, artinya ImpX sangat memungkinkan sebagai protein transmembran.
Berdasarkan analisis Model Hidden Markov menunjukkan bahwa ImpX mempunyai signal peptida dengan probabilitas 0,930. Maximum cleaveage site probability 0,640 antara
posisi asam amino 29 dan 30. Protein sekresi pada prokariot melibatkan suatu signal sequence di awal urutan asam amino, yang akan dikenali oleh signal recognition particle
SRP. Signal peptida akan dipotong oleh enzim signal peptidase Turner et al. 2000. Hasil bioinformatika ini menggambarkan bahwa ImpX adalah protein sekresi.
41
M K S L K L L L R F A T I G G L I L L L L I P L L L I R
G A V Q D R A R Y R D E A V E R V
A Q S K A G E Q Q F I A P V R V L P Y T E D V Q V T E P D E
Q G N Q R K V R R K R E G T L
L Q T P R R L K L S G E M V P S V R E V G L Y R V Q V Y S W
K A T L H A E Y D S F D Y A A A P T R A Y G Q P Y L A I G M
S D V R
G L V G T P R
L Q V N G G
K D R V R F Q S A I E R F
R K
Gambar 21. Karakter-karakter putative ABC-ATPase transporter ImpX pada Xag YR32.
Keterangan : Huruf merah : signal peptida Huruf hitam: putative transmembran
Huruf coklat : putative Walker Motif A Huruf oranye : putative signature motif
Huruf ungu : putative Walker Motif B
Putative ABC transporter memiliki Walker Motif A dan B. ImpX mempunyai diagnostic ABC ATPase Walker Motif A dan B dimulai pada posisi 155 dan 168 yang hidrofilik. Adanya
putative Walker Motif A dan B menunjukkan bahwa bagian C-terminal ImpX sebagai ATPase. Putative Signature motif berada diposisi 162. ImpX tidak mempunyai EAA motif,
hal ini memberi informasi bahwa ImpX merupakan ABC sistem ekspor. Berdasarkan analisis bioinformatik maka dapat dijabarkan bahwa ImpX merupakan
protein transmembran, suatu protein sekresi, suatu putative ABC transporter, mempunyai ATPase, dan ABC sistem ekspor. Tipe ABC–ATPase pada Xag mempunyai N-terminus
daerah hidrofobik dan transmembran yang menyatu dengan C-terminus suatu ATPase. Tipe ini termasuk tipe ABC-A1 Pearson et al. 2004. Demikian juga Saurin et al. 1999
mengemukakan bahwa ABC-A1 juga sebagai alat ekspor protein, bakteriosin, maupun
42
toksin. ABC-A1 dapat dijumpai pada prokariot dan eukariot. Diagram putative ABC transporter pada Xag dapat dilihat pada Gambar 22.
Gambar 22. Peta fisik Putative ABC-ATPase transporter ImpX pada Xag YR32.
Keterangan : A : N-terminal hidrofobik transmembran B : Signal peptida
C : putative transmembran D : C-terminal hidrofilik
E : putative Walker Motif A F : putative signature motif
G : putative Walker Motif B
Jika dihubungkan dengan posisi penyisipan transposon, maka C-terminal ImpX Xag M715 yang merupakan ATPase akan tidak stabil. Hal ini berarti situs penempelan
α dan
β dari ATP dan ion Mg , serta situs hidrolisis ATP akan terganggu dan diduga situs-situs ini
rusak karena berada masing-masing 19, 11, dan 6 asam amino dari posisi penyisipan transposon, sangat dekat dengan posisi penyisipan transposon. Kemungkinan lain, protein
hasil translasi tidak sempurna sehingga kedua situs pada ATPase berubah konform asi pada saat pelipatan protein, atau bahkan tidak terjadi pelipatan, sehingga polipeptida dicacah
protease sel nya sendiri, dan tidak ada ABC transporter untuk ekspor molekul toksin dan virulen determinan pada Xag M715. Dugaan lain, kalaupun terjadi pelipatan protein, ATPase
Xag M715 tidak berfungsi secara baik, artinya ATP tidak dapat menempel pada situsnya, sehingga tidak terjadi perubahan ATP menjadi ADP + Pi. Tidak adanya perubahan tersebut
menyebabkan tida k terbentuk energy motive force sehingga tidak ada energi untuk mendorong molekul toksin dan virulen determinan yang terlibat patogenisitas pustul bakteri
dari sitoplasma menuju lingkungan melintasi membran dalam, periplasmik dan membran luar. Hal serupa terjadi pada Staphylococcus aureus , mutasi pada sekuen Walker Motif A
akan menyebabkan hilangnya aktivitas ATPase dan transpor pada FhuC. FhuC adalah ATPase yang terlibat dalam transpor besi Speziali et al. 2006.
43
4. 5 Analisis RNA
RNA total yang terisolasi dari Xag YR32 dan Xag M715 dilihat kualitasnya melalui elektroforesis gel agarosa terdenaturasi dan hasilnya terlihat pada Gambar 23.
Gambar 23. Hasil elektroforesis sampel RNA total yang diisolasi dari berbagai Xanthomonas.
Gambar 23 memperlihatkan ada dua pita yang dominan, yaitu 23S rRNA dan 16S rRNA. Adanya dua pita tersebut berarti kualitas RNA total yang terisolasi sangat baik Jaakola et
al. 2001. RNA total dalam sel terdiri atas rRNA, tRNA, dan mRNA, kira-kira 80-85 dari total RNA adalah rRNA, 15-20 tRNA, sedangkan mRNA sekitar 1-5. Total RNA muncul
smear dengan dua pita dominan. Pita ini adalah rRNA dan yang terlihat smear adalah mRNA dengan ukuran yang berbeda. Level mRNA steady state dalam sel merupakan
integral dari hasil transkripsi dan degradasi. Pita RNA pada Xag YR32 dan Xag M715 sangat baik, sedangkan pada Xcc dan Xam, pita 16S rRNA dan 23S rRNA sangat tipis yang
menunjukkan adanya degradasi RNA selama proses isolasi dan elektroforesis. RNA total yang diisolasi kemudian ditranskripsi terbalik Reverse Transcriptase, RT
dengan Gene Specific Primer GSP yaitu primer reverse impX, sehingga diperoleh cDNA. cDNA di PCR dengan primer reverse dan forward impX. Primer didisain dari urutan
nukleotida impX yang sudah diperoleh. Hasil PCR dilarikan pada gel agarosa dan diperoleh pita ukuran sekitar 375 bp. Ukuran nukleotida sesuai dengan panjang nukleotida impX yang
diapit oleh primer forward dan reverse impX Gam bar 24. Hasil RT-PCR pada Xag YR32 berbeda nyata dengan Xag M715, pada Xag YR32
jumlah amplikon jauh lebih banyak dibandingkan dengan Xag M715. Fenomena ini mengindikasikan bahwa jumlah mRNA impX M715 jauh lebih sedikit dibandingkan mRNA
impX YR32. Seperti sudah diketahui Xag M715 adalah mutan Xag YR32 yang telah disisipi transposon mini-Tn5-Km
R
-Tp
R
. Transposon mini-Tn5-Km
R
-Tp
R
merupakan turunan dari
23S rRNA 16S rRNA
44
mini-Tn5-Km
R
, suatu transposon komposit yang memiliki stop transkripsi pada kedua batas gen penyandi antibiotik kanamisin de Lorenzo et al. 1990. Konstruksi plasmid telah
dilakukan oleh Rukayadi 1998. Mutagenesis transposon Xag YR32 dilakukan melalui pUTmini-Tn5Km
R
-Tp
R
pYR103. Tersisipnya transposon mini-Tn5-Km
R
-Tp
R
pada kromoson YR32 akan menyebabkan ketidakstabilan transkrip mRNA dari gen yang tersisipi sehingga
terjadi pemutusan ikatan fosfodiester pada mRNA. Kemungkinan lain, singkatnya waktu paruh mRNA dapat menyebabkan cepatnya proses degradasi RNA, sehingga jumlah mRNA
sangat sedikit. Pada hasil PCR dengan primer 16S rDNA tidak menghasilkan amplikon. Hal ini berarti cDNA yang terbentuk adalah hanya impX, tidak yang lainnya.
1 2 3 4 5 6 7
Gambar 24. Elektroforesis gel agarosa DNA hasil RT-PCR dari RNA total sampel.
Keterangan : 1 = marker DNA ladder Nugen, Indonesia
2 = Xag YR32 RT YR32; PCR dengan primer impX 3 = Xag M715 RT M715; PCR dengan primer impX
4 = kontrol negatif RT ddH2O; PCR dengan primer impX 5 = kontrol negatif RT YR32; PCR dengan primer 16S rDNA
6 = kontrol negatif RT M715; PCR dengan primer 16S rDNA 7 = kontrol positif pFT3551; PCR dengan primer impX
Mutagenesis transposon dapat menyebabkan perubahan nukleotida pada posisi menyisipnya transposon. Adanya terminator transkripsi akan menyebabkan berhentinya
transkripsi pada situs penyisipan dan bersifat polar. Fenomena ini yang menyebabkan terjadinya perubahan nukleotida dan asam amino yang ditranslasi.
Berdasarkan hasil analisis molekuler, transposon menyisip di gen impX di bagian C- terminal. Berdasarkan analisis bioinformatika, gen ini menyandikan suatu putative ABC-
ATPase yang berperan dalam ekspor molekul toksin dan virulen determinan dari dalam sel ke lingkungannya, dalam hal ini ke inang. Mekanisme ekspor molekul ini sangat tergantung
0,375 kb
0,4 0,7
1,25
kb
45
energi, dalam hal ini perubahan ATP menjadi ADP dan Pi. ABC transporter juga berperan dalam transportasi molekul ion dari dalam sel ke lingkungan vice versa. Swarts et al. 1998
melaporkan bahwa adanya mutasi tunggal pada H+, K+-ATPase lambung menyebabkan adanya aktivasi konstitutif ATPase. Menurut Tateno et al. 2006, adanya perubahan asam
amino C-terminal yang disebabkan oleh mutagenesis pada membran Calsium channel dapat mempengaruhi lokalisasi protein mem bran. Selain itu, Takazaki et al. 2006
menjelaskan bahwa mutasi pada C-terminal dari transporter anion manusia, mempengaruhi perubahan konformasi protein. Mereka menyimpulkan bahwa C-terminus sangat berperan
dalam perubahan konfirmasi protein pada sebagian besar anion transpor. Han et al. 2006 melaporkan bahwa C-terminal dari pori kalium memainkan peran kritis dalam aktivasi dan
fungsional pori. C-terminal dari pori ini berimplikasi juga pada lokalisasi dan gerbang pori. Analisis RNA dilanjutkan dengan analisis hibridisasi Northern untuk mengetahui
ukuran transkrip impX dan statusnya dalam kromosom terhadap gen lainnya. Hasil hibridisasi Northern dapat dilihat pada Gambar 25. Analisis Northern menunjukkan bahwa
transkrip impX berukuran sekitar 0,6 kb. Berdasarkan data di atas, impX merupakan gen yang monosistronik karena ukuran transkrip sama dengan ukuran gen. Data ini sangat
mendukung data bioinformatik, bahwa pada impX terdapat terminator atau stop transkripsi sehingga RNA polymerase akan berhenti melakukan transkripsi dan ini yang menyebabkan
ukuran transkrip sama dengan ukuran gen. Selain itu, hal ini sangat memungkinkan untuk suatu ABC-ATPase. Ukuran transkrip impX pada Xag M715 sedikit lebih kecil dibandingkan
Xag YR32, karena pada Xag M715 terdapat transposon yang menyisip di C-terminal, sekitar tiga asam amino dari stop kodon. Pada transposon ini terdapat terminator atau stop
transkripsi di sekitar awal penyisipan sehingga ukuran transkrip akan berbeda dengan tipe liarnya.
46
M 1 2 3 4 1 2 3 4
A B
Gambar 25. Elektroforesis gel agarosa terdenaturasi RNA dan analisis hibridisasi RNA Xag YR32 dan Xag M715.
Keterangan : A elektroforegram RNA YR32 dan M715. B hibridisasi RNA YR32
dan M715 dengan probe hasil RT-PCR. A dan B Lajur 1 dan 2 : YR32, lajur 3 dan 4 : M715; lajur M : Marker 1 kb DNA ladder NEB,
USA
4.6 Uji Komplementasi
