disentrifugasi selama 12000 rpm selama empat menit. Setelah pelet diresuspensi dengan 200
µ l buffer STE dan ditambahkan 40
µ l larutan SDS 10, suspensi diinkubasi
pada suhu 65
o
C selama 30 menit kemudian didinginkan pada suhu ruang. Lisis sel dilakukan dengan menambahkan empat
µ l 10 mgml Proteinase-K, lalu diinkubasi pada
suhu 37
o
C selama tiga jam. Setelah ditambah 200 µ
l buffer STE, suspensi diekstraksi dengan larutan fenol dan kloroform sebanyak 250
µ l, lalu dibolak balik secara perlahan
sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Tahap ini dilakukan sebanyak lima kali. Supernatan ditambah kloroform sebanyak 200
µ l dan
disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Tahap ini dilakukan dua kali. Supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke tabung mikro steril dan dipresipitasi dengan
satu mililiter etanol 95 dingin. Benang-benang DNA dililit menggunakan ujung tip mikro ukuran 200
µ l, lalu dikeringudarakan. DNA disuspensikan dalam ddH20 yang
mengandung 10 µ
gml RNase. Setelah diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65
o
C, DNA disimpan pada suhu –20
o
C.
3.3.2 Inverse Polymerase Chain Reaction IPCR
Inverse PCR dilakukan sesuai dengan metode seperti yang diterangkan Wahyudi et al. 2001. Primer didisain dari sekuen Pratiwi 2004 dengan urutan nukleotida P1 :
5’-ATCCTTGCCGCCATTGACCTG-3’ dan P2: 5’-CCACCGAACTTGAACTGGTC-3’. PCR dilakukan dengan LA Taq polimerase TaKaRa Bio Inc. Japan dengan kondisi
prePCR pada suhu 94
o
C selama satu menit, denaturasi pada suhu 95
o
C selama dua menit, penempelan primer pada suhu 62
o
C selama satu menit, sintesis pada suhu 72
o
C selama satu menit, postPCR pada suhu 72
o
C selama 10 menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus.
3.3.3 Isolasi dan Pemurnian Hasil PCR dan Fragmen DNA dari Gel Agarosa
Fragmen DNA dengan ukuran yang sesuai diisolasi dari gel dengan metode pemurnian DNA melalui sentrifugasi Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System,
Promega, USA. Gel sisipan dipotong-potong berbentuk kubus satu mm
3
, lalu dimasukkan ke dalam tabung mikro steril. Kemudian pada tabung mikro tersebut
ditambahkan 10 µ
l Membrane Binding Solution per 10 mg gel, divortex dan diinkubasi pada suhu 65
o
C sampai gel larut. SV Minicolumn dimasukkan ke dalam Collection Tube. Campuran gel terlarut dipindahkan pada Minicolumn kemudian diinkubasi pada suhu
ruang selama satu menit. Campuran disentrifugasi pada 12000 rpm selama satu menit. Cairan dibuang dan Minicolumn dimasukkan kembali ke Collection Tube. Untuk mencuci
sisa-sisa agarosa, DNA dicuci dengan 700 µ
l Membrane Wash Solution, lalu
disentrifugasi 12000 rpm selama satu menit. Cairan dibuang, dan Minicolumn dimasukkan kembali ke dalam Collection Tube. Pencucian diulang kembali dengan
menambahkan 500 µ
l Membrane Wash Solution, lalu disentrifugasi 12000 rpm selama lima menit. Minicolumn dipindahkan ke tabung mikro steril, kemudian ditambahkan 50
µ l
ddH
2
O, diinkubasi pada suhu ruang selama satu menit. Hasil elusi disentrifugasi pada 12000 rpm selama satu menit, lalu disimpan pada –20
o
C. Pemurnian hasil PCR dilakukan sama dengan isolasi DNA dari gel, hanya Membrane Binding Solution
ditambahkan dengan volume yang sama dengan volume PCR.
3.3.4 Kloning Gen Patogenisitas
