UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dimasukkan running buffer ke tengah ruang antara 2 plat gel sampai penuh dari sisi luar sampai merendam bagian bawah gel. Pada saat penambahan
running buffer dilakukan secara hati-hati untuk mencegah terbentuknya gelembung udara. Larutan sampel disiapkan untuk di elektroforesis.
Larutan sampel dan simulasi cangkang kapsul lunak yang telah dihidrolisis masing-masing dipipet menggunakan mikropipet sebanyak 10µl
dan dimasukkan kedalam tabung effendorf. Kedalam masing-masing tabung ditambahkan buffer sample sebanyak 10µl, tabung kemudian dipanaskan
dalam waterbath pada suhu 60°C selama 5 menit, kemudian dipipet menggunakan mikropipet sebanyak 10 µl dan dimasukkan kedalam sumuran
gel elektroforesis. Hames, 1998. Peralatan elektroforesis disambungkan pada power pack. Anoda
kutub positif dihubungkan dengan reservoir atas dan katoda kutub negatif dihubungkan dengan reservoir bawah, elektroforesis pada 150 volt dengan
arus 40 mA, Running dilakukan sampai batas gel, 1 cm dari batas bawah resolving gel. Proses elektroforesis berlangsung selama 60 menit.
Setelah proses elektroforesis selesai, gel dilepaskan dari cetakan, kemudian dilakukan visualisasi gel menggunakan comassie blue. Gel
diwarnai dengan 0,05 wv comassie blue R-250 dalam methanol 15 vv dan asam asetat 5 vv pewarnaan dilakukan diatas shaker selama
semalaman, gel kemudian gel kemudian dicuci menggunakan larutan destaining diatas shaker selama 15 menit Hames, 1998. Setelah pita terlihat
gel dicuci menggunakan aquadest.
3.6 Analisa Profil Gelatin Hasil SDS-PAGE
Analisis pola SDS-PAGE dilakukan dengan membandingkan pita protein gelatin standar, protein simulasi cangkang kapsul lunak dan protein
sampel dengan protein standar. Bobot molekul dari masing-masing protein ditentukkan dengan cara menghitung RF dari masing-masing pita protein
yang tampak pada gel. Kemudan dibuat kurva standar hubungan antara log BM dengan Rf dari protein standar sehingga BM protein sampel dapat
dihitung
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Analisis data dilakukan dengan perhitungan berat molekul BM dari masing-masing protein yang didasarkan pada marker yang tersedia.
Perhitungan dilakukan dengan mengukur total jarak tracking dari stacking gel ke separating gel a, dilanjutkan dengan mengukur jarak tracking dari
stacking gel ke masing-masing pita protein yang terbentuk b, kemudian dicari retardation factor Rf dengan membagi jarak masing-masing pita
dengan jarak tracking total ba, selanjutnya dihitung nilai log BM dari masing-masing BM pita marker. BM pita polipeptida pada sampel dihitung
dengan persamaan linear {Y = a + bX} dimana nilai RF sebagai sumbu X dan Log BM sebagai sumbu Y Mahasri, 2010.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Analisa Profil Protein dengan SDS-PAGE
Protein dibentuk dari susunan asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida.
Gambar 7. Pembentukan ikatan peptida
Ikatan peptida terbentuk oleh asam amino yang berikatan dengan asam amino lainnya. Atom H dari gugus amina berikatan dengan atom OH dari gugus
hidroksil menghasilkan air. Enzim pepsin sebagai biokatalisator akan mengkatalis pemotongan
ikatan peptida tersebut. Pepsin akan memecah molekul protein menjadi polipeptida yang lebih kecil dengan memutus ikatan peptida yang ada pada
sisi NH
2
bebas dari asam-asam amino aromatik fenilalanin, tirosin dan triptofan, hidrofobik Leusin, isoleusin dan metionin, atau dikarboksilat
glutamat dan aspartat. Kondisi lingkungan kerja enzim dibuat sedemikian dengan tujuan mendapatkan kinerja optimal dari enzim tersebut.
Analisa profil protein dilakukan menggunakan SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis berdasarkan
pemisahan protein yang telah dihidrolisis pada kondisi pH 4,5 dan temperatur 60°C selama 1 jam. Metode ini akan memisahkan protein sesuai dengan berat
molekulnya. Metode elektroforesis tidak mempengaruhi struktur biopolimer dan sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup kecil.
Hammes, B. D. 1998. Protein akan bergerak dalam satu medium yang mengandung medan listrik dan menyebabkan protein bermuatan tersebut
