Analisa Profil Protein dengan SDS-PAGE

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Analisa Profil Protein dengan SDS-PAGE

Protein dibentuk dari susunan asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Gambar 7. Pembentukan ikatan peptida Ikatan peptida terbentuk oleh asam amino yang berikatan dengan asam amino lainnya. Atom H dari gugus amina berikatan dengan atom OH dari gugus hidroksil menghasilkan air. Enzim pepsin sebagai biokatalisator akan mengkatalis pemotongan ikatan peptida tersebut. Pepsin akan memecah molekul protein menjadi polipeptida yang lebih kecil dengan memutus ikatan peptida yang ada pada sisi NH 2 bebas dari asam-asam amino aromatik fenilalanin, tirosin dan triptofan, hidrofobik Leusin, isoleusin dan metionin, atau dikarboksilat glutamat dan aspartat. Kondisi lingkungan kerja enzim dibuat sedemikian dengan tujuan mendapatkan kinerja optimal dari enzim tersebut. Analisa profil protein dilakukan menggunakan SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis berdasarkan pemisahan protein yang telah dihidrolisis pada kondisi pH 4,5 dan temperatur 60°C selama 1 jam. Metode ini akan memisahkan protein sesuai dengan berat molekulnya. Metode elektroforesis tidak mempengaruhi struktur biopolimer dan sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup kecil. Hammes, B. D. 1998. Protein akan bergerak dalam satu medium yang mengandung medan listrik dan menyebabkan protein bermuatan tersebut UIN Syarif Hidayatullah Jakarta bergerak dalam medium yang disebabkan perbedaan polaritas. Mobilitas molekul protein dipengaruhi beberapa faktor diantaranya bentuk molekul, ukuran molekul, konsentrasi gel, waktu elektroforesis dan voltase elektroforesis yang digunakan dalam gel. Elektroforesis diatur dengan tegangan 150 v dengan arus sebesar 40 mA. Pengaturan ini dapat dimodifikasi sesuai dengan keperluan. Pengaturan tersebut dipilih karena memberikan hasil yang paling baik diantara percobaan-percobaan yang telah dilakukan. Sumber arus listrik yang stabil diperlukan untuk menghasilkan aliran listrik dengan voltase yang konstan. Larutan buffer kemudian dialirkan kedalam tangki penyangga untuk menggantikan air yang hilang, dan ini mengakibatkan pergeseran pita –pita. Pemanasan yang berlebih menyebabkan senyawa-senyawa terdenaturasi. Metode –metode pendinginan medium pemisahan dapat dilakukan, sehingga kekuatan medan 100V cm dapat digunakan. Keuntungan elektroforesis pada voltase tinggi adalah terjadinya pemisahan yang cepat Bintang, 2010. Setelah marker, standar dan sampel dielektroforesis didapatkan hasil berupa lembaran gel, kemudian lembaran gel tersebut diwarnai dengan Bromophenol Blue dan diinterpretasikan dengan scaner. Setelah didapatkan hasil gambar dalam bentuk soft copy, kemudian diukur panjang tracking pita dari atap sumuran sampai dasar sumuran, jarak tracking tiap band dari atap sumuran sampai tiap-tiap pita yang terdeteksi dihitung dengan rumus persamaan regresi linear untuk mengetahui berat molekul pada masing- masing band pita protein. Pada penelitian ini sampel terdiri dari empat produk vitamin yang berbeda, marker protein serta gelatin standar dan simulasi. Untuk marker disebutkan selanjutnya kolom satu, standar gelatin sapi kolom dua, standar gelatin babi kolom tiga, simulasi cangkang kapsul gelatin sapi kolom 4, simulasi cangkang kapsul gelatin babi kolom 5, sampel Pharmaton kolom 6, sampel Omepros kolom 7, sampel Obipluz kolom 8, sampel Nature E kolom 9 dan standar gelatin sapi tanpa enzim kolom 10. Dari hasil penelitian diperoleh pita dari masing-masing sampel gelatin cangkang kapsul dan gelatin simulasi. Kemudian dilakukan skrining UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pita-pita protein untuk ditentukan nilai faktor retensi Rf dan berat molekulnya BM. Penentuan nilai Rf dari pita marker protein dihitung dengan cara membagi jarak pita jarak dari sumuran sampai ke pita dengan batas akhir garis elektroforesis. Terbentuk 9 pita marker protein dengan berat molekul 200 KDa, 116 KDa, 97,4 KDa, 66 KDa, 45 KDa, 31 KDa, 21.5 KDa dan 14.5 KDa. Berat molekul marker protein yang telah diketahui kemudian dihitung nilai BM-nya. Perhitungan logaritma BM dan nilai Rf dapat dilihat pada tabel 7. Hasil elektroforesis marker protein dan protein sampel dapat dilihat pada gambar 8. KDa 200 Gambar 8. Gel Hasil Elektroforesis. Keterangan gambar: 1 = Marker, 2 = Standar Gelatin Sapi, 3 = Standar Gelatin Babi, 4 = Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin Sapi, 5 = Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin Babi, 6 = Sampel Pharmaton, 7 = Sampel Omepros, 8 = Sampel Obipluz, 9 = Nature E, 10 = Standar gelatin sapi tanpa enzim. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 116 97.4 66 14.5 21.5 31 45 6.5 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Analisa diawali dengan perhitungan regresi linear seri log bobot molekul pita pemisahan marker sebagai sumbu y dan nilai Rf sebagai sumbu x. Tabel 8. Nilai Log BM dan Nilai RF Marker Protein No BM KDa Log BM Pergerakan warna mm Jarak Pita mm Rf x 1 200 2.30 57 5.0 0.08 2 116 2.06 57 11.5 0.20 3 97.4 1.99 57 16 0.29 4 66 1.82 57 19.5 0.32 5 45 1.65 57 25.5 0.45 6 31 1.49 57 31 0.54 7 21.5 1.33 57 42 0.74 8 14.5 1.16 57 53.5 0.94 9 6.5 0.82 57 57 1 Kemudian dibuat kurva standar nilai RF yang diperoleh terhadap nilai log BM yang dapat dilihat pada gambar 8. Hasil regresi linear diatas kemudian digunakan untuk menghitung bobot molekul pita pemisahan protein gelatin. Berdasarkan perhitungan diperoleh nilai a = 2,262, b = -1,316 dan nilai r = - 0,968. Maka diperoleh rumus y = -1,316x + 2,262, dengan rumus yang diperoleh dapat ditentukkan nilai Rf, BM dan Log BM dari pita protein sampel yang terbentuk. 2,3 2,06 1,99 1,82 1,65 1,49 1,33 1,16 0,82 0,5 1 1,5 2 2,5 0,08 0,2 0,29 0,32 0,45 0,54 0,74 0,94 0,98 Lo g BM rf Kurva Standar Marker Protein Gambar 9 . Kurva Regresi Linear Standar Marker Protein UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 9. Bobot Molekul Pita Gelatin Babi, Gelatin Sapi, Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin Sapi, Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin Babi, dan Sampel. NO SGS mm SGB mm SCKS mm SCKB mm P mm OM mm OB mm NE mm SGSTE mm BM kDa 1 20,5 20,5 20,5 20,5 20,5 20,5 20,5 20,5 - 61,52 2 26 - 26 - - - 26 26 45,92 3 31 31 31 31 31 31 31 31 - 35,16 4 - 35,5 - 35,5 - - - - - 27,67 5 40 - 40 - - 40 40 40 - 21,78 4 - 41 - 41 - - - - - 20,65 5 - 54 - 54 - - - - - 10,35 Keterangan : SGS=Standar Gelatin Sapi, SGB=Standar Gelatin Babi, SKCS=Simulasi Cangkang Kapsul Sapi, SCKB=Simulasi Cangkang Kapsul Babi, P=Pharmaton, OM=Omepros, OB=Obipluz, NE=Nature E, SGSTE=Simulasi Gelatin Sapi Tanpa Enzim.

4.2 Pembahasan