UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gel poliakrilamid dapat digunakan tidak hanya untuk pemisahan dari berbagai protein, tetapi juga untuk membandingkan berat molekulnya.
Teknik ini dapat digunakan baik untuk tujuan preparatif maupun pemisahan analitik dari sampel protein. Teknik elektroforesis ini hanya diperlukan
beberapa mikrogram sampel saja Bintang, 2010. Poliakrilamid dapat memisahkan protein dengan kisaran berat 500
– 250.000 bp atau polinukleotida dengan kisaran 5
–2000 bp. Pori matriks ini terbentuk dari ikatan silang Antara akrilamid dan bis
–akrilamid. Ukuran pori pada gel poliakrilamid dapat dikecilkan dengan cara meningkatkan
persentase total akrilamid T atau dengan meningkatkan banyaknya ikatan silang C dengan bis
– akrilamid Fatchiyah, 2011. Gel 20T C bis berarti bahwa kandungan total akrilamid dan
bis –akrilamid sebesar 20 w v dimana kandungan bis–akrilamid 5 dari
total akrilamid dan bis –akrilamid. Pada T yang sama, 5C menghasilkan
ukuran pori terkecil. Diatas dan dibawah 5C, besarnya pori bertambah. Untuk mendapatkan hasil pemisahan protein yang diinginkan, diperlukan T
tertentu yang sesuai. T yang terlalu tinggi akan menghalangi bergeraknya protein, sedangkan T yang terlalu rendah akan menyebabkan protein
protein kurang atau tidak memisah karena protein bergerak sangat cepat pada gel Fatchiyah, 2011.
Polimer yang terbentuk menyebabkan gel berpori –pori. Besarnya
pori –pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi akrilamid dan bis–
akrilamid. Jika diameter pori gel sama dengan X, maka protein dengan ukuran lebih kecil dari X akan mudah dan cepat bergerak kedalam gel, sedangkan
molekul berukuran lebih besar dari X juga akan bergerak tetapi lebih lambat Fatchiyah, 2011.
2.9.1 Medium Penyangga
Teknik elektroforesis dapat dibagi menjadi dua bagian, yaitu elektroforesis free boundary dan elektroforesis zona. Elektroforesis free
boundary merupakan pemisahan parsial dalam tabung gelas vertikal dari campuran protein yang membentuk suatu boundary dengan bufer yang sesuai.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Penerapan arus listrk menghasilkan pergerakan protein, karena terjadi migrasi dengan laju yang berbeda maka protein akan terpisah Bintang, 2010.
Pada elektroforesis zona, dengan melakukan pemisahan pada medium penyangga seperti gel poliakrilamid, akan diperoleh pita protein
yang lebih stabil. Konsentrasi gel harus disesuaikan agar tidak terlalu encer dan juga tidak terlalu padat bintang, 2010. Pada elektroforesis dalam
matriks gel poliakrilamid, protein memisah ketika protein bergerak melalui matriks tiga dimensi dalam medan listrik. Matriks poliakrilamid berfungsi
untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH buffer agar muatan protein tidak berubah Fatchiyah, 2011.
2.9.2 Sampel
Larutan yang dipisahkan mempengaruhi laju migrasi termasuk muatan, ukuran, dan bentuk molekul terlarut. Muatan total akan meningkat
apabila laju migrasi meningkat, besarnya muatan biasanya tergantung pada pH. Ukuran molekul yang lebih besar menyebabkan migrasi menurun dan
kekuatan elektrostatika disekitar larutan meningkat, sedangkan bentuk molekul yang berbeda dengan ukuran yang sama seperti protein globular dan
fibrous dikarakteristik menghambat migrasi, karena perbedaan bentuk molekul dapat mempengaruhi pergerakan molekul dan kekuatan elektrostatik
Bintang, 2010. Protein merupakan molekul amfoter karena mempunyai gugus
amino positif dan karboksil negatif. Dengan demikian, protein dapat mengion, baik pada pH basa maupun pada pH asam. Pada pH rendah, protein
bersifat sebagai kation bermuatan positif yang cenderung bergerak kearah katoda elektroda negatif. Pada pH tinggi, protein bersifat sebagai anion
bermuatan negatif yang cenderung bergerak kearah anoda elektroda positif. Nilai diantara kedua pH tersebut dinamakan titik isoelektrik
isoelectric point atau pI yaitu nilai pH dimana protein menjadi tidak bermuatan. Pada pH tersebut, jumlah muatan negatif yang dihasilkan dari
proteolisis sebanding dengan jumlah muatan positif yang diperoleh dari
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
penangkapan proton. Protein yang tidak bermuatan tidak dapat bergerak pada medan listrik Fatchiyah, 2011.
Hampir semua protein mempunyai pH kurang dari 8,0. Oleh karena itu, pH buffer elektroforesis yang berkisar 8
–9 akan menyebabkan sebagian besar protein bermuatan negatif yang akan bergerak ke anoda Fatchiyah,
2011.
2.9.3 Buffer
