Pembuatan preparat Pengamatan mikroskopik jaringan daging ikan patin

Analisis kuantitatif asam lemak dihitung dengan rumus : Asam lemak = 100 − x 100 a b Gambar 7 Kromatografi gas a dan rekorder b Kondisi alat GC pada saat analisis: a Kolom : Cyanopropil methyl sil capilary column b Dimensi kolom : P = 60 m, Ø dalam = 0,25 mm, 0,25 µm film Tickness c Laju alir N 2 : 30 mLmenit d Laju alir H 2 : 40 mLmenit e Laju alir udara : 400 mLmenit f Suhu injektor : 220 °C g Suhu detektor : 240 °C h Suhu terprogram : 125-225 °C i Inject volume : 1 µL

3.3.6 Pengamatan mikroskopik jaringan daging ikan patin

Pengamatan jaringan daging fillet ikan patin terdiri atas tahap pembuatan preparat dan pemeriksaan preparat. Bagian daging yang diambil adalah daging di dekat titik tengah ikan patin yang sudah difillet.

3.3.6.1 Pembuatan preparat

Pembuatan preparat histologi terdiri dari tiga tahapan besar, yaitu fiksasi jaringan dan parafinasi, pemotongan jaringan serta pewarnaan jaringan. 1 Fiksasi jaringan dan parafinasi a Fiksasi Fiksasi adalah tahapan yang dilakukan untuk mencegah autolisis dan dekomposisi post-mortem dari suatu jaringan atau organ. Fiksasi juga bertujuan untuk mengawetkan morfologi dan komposisi jaringan, sehingga jaringan tetap seperti pada keadaan semula sewaktu hidup, mengeraskan jaringan agar dapat diiris serta mencegah jaringan larut selama proses pembuatan preparat. Larutan fiksatif yang digunakan adalah larutan Bouin’s yang memiliki komposisi asam pikrat, formalin dan asam asetat glasial dengan perbandingan 15:5:1. Jaringan direndam dalam larutan fiksatif selama 48 jam. Perendaman dilakukan di dalam botol film dengan volume larutan fiksatif sebanyak 15-20 kali volume jaringan. b Dehidrasi Dehidrasi merupakan proses untuk mengeluarkan cairan dari dalam sel dengan cara merendam jaringan yang telah difiksasi ke dalam alkohol dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi. Pertama, jaringan direndam dalam alkohol 70 selama 24 jam. Perendaman dilakukan dalam botol film yang sebelumnya telah digunakan untuk perendaman dengan larutan fiksatif. Larutan fiksatif dibuang terlebih dahulu, kemudian alkohol dengan konsentrasi 70 dimasukkan ke dalam botol film hingga jaringan terendam. Selanjutnya organ diambil dari dalam botol film dan dibungkus menggunakan kain kasa. Kemudian kain kasa diikat menggunakan benang yang dibentuk seperti teh celup agar memudahkan dalam proses pergantian alkohol. Setelah 24 jam, organ yang dibungkus kain kasa diambil dan ditiriskan di atas kertas tisu. Kemudian organ tersebut dimasukkan ke dalam botol berisi alkohol 80, 90, 95 masing-masing selama dua jam dan alkohol 100 selama 2 jam dengan cara yang sama. Perendaman dilakukan pada suhu ruang. c Clearing Clearing merupakan proses penjernihan yang bertujuan untuk menggantikan alkohol sekaligus menambahkan clearing agent xylol yang berfungsi sebagai pelarut parafin. Jaringan direndam dalam alkohol-xylol 1:1 selama 30 menit, dilanjutkan dengan xylol I, xylol II dan xylol III masing-masing selama 30 menit. Perendaman dilakukan sama halnya seperti pada perendaman dengan alkohol pada suhu ruang. d Impregnasi Impregnasi adalah tahap penggantian xylol dengan parafin cair yang berlangsung di dalam oven dengan suhu 60 °C. Proses ini dilakukan dengan perendaman jaringan ke dalam xylol-parafin 1:1 yang diletakkan dalam gelas piala selama 45 menit. Proses perendaman dilakukan dengan cara yang sama seperti proses perendaman sebelumnya. e Embedding Embedding merupakan proses untuk memasukkan parafin cair ke dalam sel. Proses ini berlangsung di dalam oven dengan suhu 60 °C. Titik cair parafin yaitu 54-58 °C. Proses ini bertujuan agar parafin menyusup ke dalam seluruh celah antar sel dan bahkan ke dalam sel, sehingga jaringan lebih tahan saat pemotongan. Jaringan direndam secara berturut-turut ke dalam gelas piala yang berisi parafin I, parafin II dan parafin III masing-masing selama 45 menit. Proses perendaman dilakukan dengan cara yang sama seperti proses perendaman sebelumnya. f Blocking Jaringan yang telah direndam dalam parafin cair lalu diblok dicetak agar mudah dipotong dengan parafin cair yang kemudian dibekukan. Proses ini membutuhkan cetakan yang dapat dibuat dari kertas yang kaku seperti kertas kalender dengan ukuran 2x2x2 cm 3 . Parafin cair dituangkan ke dalam cetakan hingga memenuhi 18 bagian cetakan dan dibiarkan hingga sedikit membeku. Setelah itu, jaringan disusun dalam cetakan dengan bagian sayatan yang diperlukan menghadap dasar cetakan dan dituangi parafin cair hingga material jaringan terendam. Selanjutnya dibiarkan membeku dalam suhu ruang selama 24 jam. g Trimming Setelah parafin beku dengan sempurna, blok parafin dikeluarkan dari cetakan lalu dipotong menggunakan silet bermata satu agar dapat disesuaikan dengan tempat blok pada alat pemotong. 2 Pemotongan jaringan Pemotongan jaringan dilakukan dengan menggunakan mikrotom. Ketebalan sayatan yaitu 4 mikron. Teknik pemotongan parafin adalah sebagai berikut. a Blok parafin yang mengandung preparat diletakkan pada tempat duduknya di mikrotom. Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian diletakkan pada pemegangnya holder pada mikrotom yang dikunci dengan kuat. Mata pisau mikrotom harus tajam agar proses pemotongan dapat dilakukan dengan sempurna. b Ketebalan potongan diatur dengan cara menggeser bagian pengatur ketebalan hingga ketebalan yang diinginkan. Ketebalan sayatan yaitu 4 mikrometer. c Blok preparat digerakkan ke arah pisau sedekat mungkin lalu balok preparat dipotong secara teratur dan ritmis. Pita-pita parafin yang awal tanpa jaringan dibuang hingga diperoleh potongan yang mengadung preparat jaringan. d Hasil irisan diambil dengan jarum, lalu diletakkan di permukaan air hangat dalam 45-50 °C waterbath hingga mengembang. e Setelah pipa parafin terkembang dengan baik, pita parafin tersebut ditempelkan pada gelas objek yang telah diberi zat perekat, yaitu albumin dengan cara memasukkan kaca objek itu ke dalam waterbath dengan hati-hati agar pita parafin tidak melipat dan dibiarkan hingga mengering. 3 Pewarnaan jaringan a Dewaxing Sebelum dilakukan dewaxing, gelas objek yang berisi jaringan diletakkan dalam keranjang preparat yang ukurannya sesuai dengan gelas objek. Keranjang tersebut dapat diisi dengan 10 gelas objek. Dewaxing merupakan proses untuk mengeluarkan parafin. Wadah perendaman berupa wadah berbentuk persegi panjang yang ukurannya sesuai dengan keranjang untuk gelas objek. Jaringan pada gelas objek yang telah diletakkan dalam keranjang direndam ke dalam xylol I dan xylol II masing-masing selama dua menit. Lilin akan terlepas dari jaringan dan jaringan akan tampak jernih. b Hidrasi Hidrasi merupakan proses pemasukan air ke dalam preparat jaringan pada gelas objek setelah proses dewaxing. Jaringan pada gelas objek yang sebelumnya telah melalui proses dewaxing kemudian direndam dalam alkohol 100 dalam wadah perendaman seperti pada proses dewaxing sebanyak dua kali, lalu secara berturut-turut dimasukkan ke dalam alkohol 95, 90, 80, 70 dan 50 masing-masing selama dua menit dengan cara yang sama pula. Setelah itu, preparat jaringan direndam ke dalam akuades selama dua menit. c Pewarnaan hematoksilin-eosin Setelah hidrasi, preparat jaringan diberi pewarna hematoksilin-eosin. Pertama, preparat jaringan direndam dengan pewarna hematoksilin selama tujuh menit, kemudian dicuci dengan air mengalir selama tujuh menit untuk menghilangkan kelebihan zat warna yang tidak diserap. Selanjutnya preparat jaringan direndam dengan pewarna eosin selama tiga menit dan dicuci dengan akuades. Alat dan proses perendaman yang dilakukan sama seperti proses perendaman sebelumnya. d Dehidrasi Preparat jaringan kemudian direndam dalam alkohol 70, 85, 90 dan 100 masing-masing dilakukan selama dua menit. Selanjutnya preparat jaringan direndam dalam xylol I dan xylol II masing-masing selama dua menit. Alat dan proses perendaman yang dilakukan sama seperti proses perendaman sebelumnya. e Mounting Preparat jaringan yang telah diwarnai dapat dibuat preparat yang lebih awet dengan cara mounting menggunakan mounting agent yaitu enthellan. Preparat jaringan ditutup dengan gelas penutup yang sudah ditetesi enthellan yang dikeringkan dalam oven pada suhu 40 °C selama 24 jam, kemudian diamati di bawah mikroskop.

3.3.6.2 Pemeriksaan preparat