IFN- γ dihasilkan oleh sel NK dan merupakan bagian dari respon imun bawaan dan
juga dihasilkan oleh CD4 T-Helper1. d. IL-4 adalah sitokin T-helper 2 yang merupakan suatu anti-inflamatori yang
memiliki peran sebagai anti apoptosis. Sitokin ini penting yang terlibat dalam IgG, IgE, dan ekspresi MHC kelas II. Interleukin IL-4 merupakan sitokin
penting dan tampaknya mempunyai kerja yang paradoks. Tumor-tumor yang secara genetik diubah untuk menghasilkan IL-4 akan dirusak, sedang tumor-tumor
parental akan tumbuh progresif. Namun beberapa penelitian menunjukkan bahwa IL-4 mengandung molekul yang merangsang pertumbuhan tumor. IL-4 meninggi
pada beberapa penderita kanker. e. Hasil pulasan imunohistokimia IFN-
γ dan IL4 adalah tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel dinyatakan dengan :
- Negatif : bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana saat proses yang sama kontrol + menampilkan warna coklat dengan pewarnaan kromogen
DAB. - Positif : bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel epitel
dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x.
3.8 Cara Kerja
Pada penelitian ini, semua slide dari ovarium yang telah didiagnosis sebagai tumor jinak dan ganas epitel ovarium tipe serosum dan musinosum dikumpulkan.
Dilakukan pembacaan ulang oleh dua patologis bersamaan dengan peneliti. Setelah itu dilakukan pemotongan ulang blok parafin dari sampel tumor ovarium
Universitas Sumatera Utara
untuk dilakukan pewarnaan imunohistokimia IFN- γ dan IL-4 dan pada waktu
pewarnaan IFN- γ dan IL -4 sampel diambil dilakukan secara non random.
3.8.1 Pembuatan Sediaan Mikroskopis Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut :
1. Blok parafin yang telah dikumpulkan, kemudian disimpan di dalam lemari pendingin freezer sehingga sediaan cukup dingin, selanjutnya sediaan dipotong
tipis dengan menggunakan mikrotom dengan ketebalan 4µm. Setiap blok parafin dipotong ulang sebanyak 2 kali untuk pulasan imunohistokimia IFN-
γ dan IL-4. 2. Sampel blok parafin yang sudah dipotong tipis kemudian ditempelkan pada
kaca objek. Pada pulasan imunohistokimia IFN-
γ dan IL-4 digunakan kaca objek khusus yang telah dicoating dengan poly-L-lysine atau sialanized slide agar jaringan yang
telah dipotong ulang dapat menempel pada kaca objek selama dilakukan pulasan imunohistokimia IFN-
γ dan IL-4. Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek sialanized adalah dengan cara menggunakan ujung pisau atau pinset
berujung runcing. Potongan tipis dipisahkan dan diratakan dengan
memasukkannya ke dalam air hangat. Setelah mengembang, pindahkan ke atas kaca objek. Selanjutnya kaca objek diletakkan di atas alat pemanas hot plate
suhu 50
o
C-60 C. Setelah paraffin melunak, kaca objek dikeringkan dan potongan
jaringan siap untuk dipulas dengan pewarnaan imunohistokimia IFN- γ dan IL-4.
3.8.2 Prosedur sebelum pulasan antibodi primer 1. Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan setebal 4 µm yang telah
ditempelkan pada kaca objek sialanized.
Universitas Sumatera Utara
2. Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit.
3. Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan ke dalam alkohol absolute, kemudian alkohol 90, 80 dan 70 masing-masing selama 4 menit.
4. Kemudian dicuci dengan air mengalir selama 5 menit. 5. Blocking preparat dengan mencelupkannya ke dalam Endogenous Peroksidase
0,5 Methanol 100 ml + H2O2 1,6 ml selama 30 menit. 6. Cuci lagi dengan air mengalir selama 5 menit.
7. Masukkan preparat ke dalam cairan buffer sitrat dan dipanaskan di dalam microwave :
- Cook I, power level 8 selama 5 menit. - Cook II, power level 1 selama 5 menit.
8. Kemudian dinginkan sediaan selama ± 30 menit dalam suhu ruangan. 9. Bilas dengan PBS pH 7,4 selama 3 menit dan keringkan air di sekitar potongan
jaringan. 10. Tandai di sekeliling jaringan yang ingin dipulas dengan Pap Pen.
11. Blocking preparat dengan meneteskan Normal Horse Serum 3 dan dibiarkan selama 15 menit di dalam bak inkubasi.
3.8.3 Protokol pulasan imunohistokimia IFN- γ dan IL-4 dengan menggunakan
REAL En Vision dari Dako. 1. Bersihkan preparat dari Normal Horse Serum.
2. Teteskan preparat dengan antibodi primer IFN- γ dan IL-4, dan biarkan selama
60 menit dalam rak inkubasi.
Universitas Sumatera Utara
3. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 3 menit. 4. Teteskan preparat dengan Dako REAL En Vision secukupnya dan dibiarkan
selama 30 menit dalam rak inkubasi. 5. Cuci dengan PBS pH 7,4 + Tween 20 selama 5-10 menit.
6. Teteskan preparat dengan DAB + substrat buffer Dako dan biarkan selama 2-5 menit.
7. Cuci kembali dengan air mengalir selam 10 menit. 8. Counterstain preparat dengan pewarnaan Hematoksilin selama 1-2 menit.
9. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit. 10. Masukkan preparat ke dalam larutan Lithium Carbonat jenuh 5 dalam
akuades selama 2 menit. 11. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit.
12. Dehidrasi dengan cara mencelupkan preparat secara berurutan ke dalam alkohol 80, 96. dan alkohol absolut, masing-masing selama 5 menit.
13. Clearing dengan cara mencelupkan preparat ke dalam larutan xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit.
14. Lakukan mounting dan tutup dengan kaca penutup.
3.9 Alat dan Bahan
