3. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 3 menit. 4. Teteskan preparat dengan Dako REAL En Vision secukupnya dan dibiarkan
selama 30 menit dalam rak inkubasi. 5. Cuci dengan PBS pH 7,4 + Tween 20 selama 5-10 menit.
6. Teteskan preparat dengan DAB + substrat buffer Dako dan biarkan selama 2-5 menit.
7. Cuci kembali dengan air mengalir selam 10 menit. 8. Counterstain preparat dengan pewarnaan Hematoksilin selama 1-2 menit.
9. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit. 10. Masukkan preparat ke dalam larutan Lithium Carbonat jenuh 5 dalam
akuades selama 2 menit. 11. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit.
12. Dehidrasi dengan cara mencelupkan preparat secara berurutan ke dalam alkohol 80, 96. dan alkohol absolut, masing-masing selama 5 menit.
13. Clearing dengan cara mencelupkan preparat ke dalam larutan xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit.
14. Lakukan mounting dan tutup dengan kaca penutup.
3.9 Alat dan Bahan
3.9.1 Alat-alat penelitian Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah mikrotom, waterbath,
hot plate, freezer, incubator, staining jar, rak kaca objek, rak inkubasi, pensil diamond, pipet mikro, timbangan bahan kimia, kertas saring, stopwatch, gelas
Universitas Sumatera Utara
Erlenmeyer, gelas beker, tabungan sentrifuge, microwave, thermolyte strirrer, kaca penutup, entelan dan mikroskop cahaya.
3.9.2 Bahan Penelitian 1. Blok parafin yang telah didiagnosa dengan pulasan hematoksilin eosin sebagai
tumor epitel ovarium. 2. Pulasan imunohistokimia menggunakan metode REAL EnVision. Antibodi
primer yang digunakan adalah IFN- γ dan IL-4 dengan pengenceran 1:50 – 1;100.
3. Detection kit terdiri dari : - 1 botol endogenous enzyme block
- 1 botol Normal Horse Serum 5 - 1 botol Dako REAL EnVision
- 1 botol DAB + substrat chromogen 4. Larutan PBS pH 7,4 :
- Natrium chloride : 80 gram - Kalium chloride : 2 gram
- NaHPO4 : 11 gram - KH2PO4 : 2 gram
- Tambahkan aquadest : 1000 ml 5. Larutan Tweet 20.
6. Larutan DAB + substrat buffer 1 ml larutan cukup untuk 10 jaringan. Langkah 1 : masukkan 1 ml aliquot substrat secukupnya ke dalam countainer
tergantung dari jumlah spesimen yang akan dikerjakan.
Universitas Sumatera Utara
Langkah 2 : untuk setiap 1 ml buffer, tambahkan satu tetes 20 mikroliter cairan DAB + substrat chromogen dan campurkan segera.
7. Larutan couterstain Mayers Haematoksilin. 8. Larutan Lithium Carbonat.50 gram. Lithium Carbonas ditambah aquadest 1000
ml. 9. Alkohol absolute 96, 80,70.
10. Larutan xylol.
3.10 Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pulasan imunohistokimia IFN-
γ dan IL-4 terhadap sampel sediaan jaringan ovarium. Untuk penilaian terhadap pulasan imunohistokimia IFN-
γ dan IL-4 adalah sebagai berikut: - Negatif : bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana saat proses
yang sama kontrol + menampilkan warna coklat dengan pewarnaan kromogen DAB.
- Positif : bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel epitel dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x.
Skor jumlah sel yang terwarnai : 0 : tidak ada sel yang terwarnai 1 : 25 jumlah sel yang terwarnai
2 : 25-75 jumlah sel yang terwarnai 3 : 75 jumlah sel yang terwarnai
Skor tampilan warna : 1 : lemah 2 : sedang
3 : kuat
Universitas Sumatera Utara
Skor intensitas warna = skor jumlah sel yang terwarnai x skor tampilan warna Interpretasi skor intensitas warna : Lemah : 1-3
Sedang : 4-6 Kuat : 7-9
Adapun cara menginterpretasikan tampilan imunohistokimia tersebut di atas adalah modifikasi dari Q-score.
40
Hasil negatif atau “false positif ” pada sediaan ini kemungkinan masalah fiksasi yang salah atau terjadi kesalahan pada waktu
prosesing, sehingga sediaan rusak.
3.11 Analisa Data
