UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Prosedur pengukuran hormon dilakukan berdasarkan instruksi manual yang disertakan dalam kit.
Pertama-tama setiap 25µL dari masing-masing standar, control dan sampel dimasukkan ke dalam sumuran pada plat. Dua ratus mikro liter
Enzyme Conjugate dimasukkan ke dalam setiap sumuran dan campur secara menyeluruh selama 10 detik. Plat diinkubasi selama 60 menit pada
suhu ruang tanpa menutup plat. Dengan cepat isi dalam sumuran ditumpahkan kemudian masing-masing sumurna dicuci dengan Wash
Solution 400µL setiap sumuran, proses tersebut diulangi sebanyak tiga kali, lalu plat dibenturkan pada kertas penyerap untuk menghilangkan sisa
tetesan pada sumuran. Sebanyak 200µL Substrate Solution ditambahkan ke dalam setiap sumuran lalu inkubasi selama 15 menit pada suhu ruang.
Reaksi enzimatik dihentikan dengan menambahkan 100µL Stop Solution kedalam setiap sumuran. Absorban dari tiap sumuran ditentukan dengan
menggunakan Microtiter plate ELISA reader pada panjang gelombang 450 ± 10 nm. Pembacaan sumuran sebaiknya dilakukan dalam 10 menit
penambahan Stop Solution.
2. Pengukuran Konsentrasi Spermatozoa
Pengukuran konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan cara mengambil spermatozoa pada kauda epididimis. Spermatozoa yang
didapat diletakkan pada kaca arloji yang berisi cairan NaCl 0,9 sebanyak 500µL. Spermatozoa dimasukkan kedalam bilik hitung Neubauer
Hemasitometer sampai kamar Neubauer terisi rata. Kemudian dihitung jumlah spermatozoa pada salah satu kamar hitung Neubauer dan
selanjutnya ditentukan pengenceran yang akan dilakukan dan jumlah kotak yang akan dihitung Tabel 3.2.
Tabel 3.2 Pengenceran yang dilakukan dan kotak yang dihitung
No. Jumlah spermatozoa dalam
1 kotak Pengenceran
Kotak yang dihitung
1. 40
50 kali 5
2. 15
– 40 20 kali
10 3.
15 10 kali
25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Berdasarkan jumlah spermatozoa yang diketahui, maka dilakukan pengenceran spermatozoa berdasarkan jumlah spermatozoa yang dihitung
Ilyas, 2007.
Tabel 3.3 Cara Pengenceran
No. Pengenceran
Pembuatan Pengenceran 1.
50 kali a. 980µL Larutan George + 20µL spermatozoa
b. 2.450µL Larutan George + 50µL spermatozoa 2.
20 kali 950µL Larutan George + 50 µL spermatozoa
3. 10 kali
a. 900µL Larutan George + 100µL spermatozoa b. 450µL Larutan George + 50µL spermatozoa
Keterangan : Poin a dan b menunjukkan opsi perlakuan pilih salah satu
Tahapan selanjutnya jika telah dilakukan pengenceran, dilakukan perhitungan spermatozoa dengan jumlah kotak yang dihitung sesuai
dengan jumlah spermatozoa dan cara pengenceran pada tabel diatas. Kemudian dilakukan pengukuran spermatozoa sesuai rumus dibawah ini
Keterangan : n
: jumlah spermatozoa yang terhitung 10.000
: volume kamar hitung Neubauer Fp
: faktor pengenceran yang dilakukan 25
: total kotak kecil yang terdapat dalam kamar hitung Neubauer k
: jumlah kotak kecil yang dihitung saat pengamatan v NaCl
: volume NaCl mL fisiologis yang digunakan
Tabel 3.4 Rumus Konsentrasi Spermatozoa
No. Jumlah kotak yang dihitung
Rumus konsentrasi spermatozoa 1.
5 n x 10.000 x 50 x 5 x 0,5
2. 10
n x 10.000 x 20 x 2,5 x 0,5 3.
25 n x 10.000 x 10 x 1 x 0,5
Konsentrasi spermatozoa = n x 10.000 x Fp x x Nacl
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3. Pengamatan Morfologi Spermatozoa
