Jenis Penelitian Analisis Data

commit to user 19

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan terdiri dari: tabung reaksi, rak tabung reaksi, cawan petri, gelas beker, gelas benda, jarum ose, pipet mikro 20 l, 200l, 1000 l, tip 20l, 200l, 1000l, ependorf 100l, 1,5ml, bunsen, autoklaf, neraca, sentrifuge, vortex, sarung tangan, masker, inkubator, lemari es, Laminar Air Flow Cabinet , Waterbath, Digital Mikroskop, PCR, Spektofotometer UV-VIS, Elektroforesis DNA horizontal, Gel Doc , dan DNA sequencer .

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan antara lain: tripton 1, NaCl 1, yeast extract 0,5, bacto agar 2, glukosa 2,5, Na-fitat 0,4, bekatul 2,5, aquades, kristal violet, iodium, safranin, CaCl 2 , NH 4 NO 3 , KCl, MgSO 4 .7H 2 O, FeSO 4 .7H 2 O, MnSO 4 .H 2 O, KH 2 PO 4 , Ammonium molibdat, Ammonium metavanadat, HNO 3 , Natrium asetat, HCl, NaOH, alkohol 70, isopropanol, agarosa, DNA kit Promega, buffer TBE, EDTA, lisozym, etidium bromida, loading dye , master mix PCR Gotaq green, ddH 2 O, marka DNA 1kb, primer forward 27f 5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’, dan primer reverse 765r 5’CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC 3’.

C. Jenis Penelitian

Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian deskriptif eksploratif. Sampel air dan lumpur diambil dari kawah Sikidang Dieng pada bulan Oktober 2011, kemudian sampel dianalisis di Laboratorium. commit to user 20

D. Prosedur Penelitian

1. Pengayaan dan pemurnian mikroorganisme

Satu ml air sampel ditambahkan dengan 9 ml larutan fisiologis, dan dilakukan pengenceran sampai diperoleh larutan dengan pengenceran 10 -8 . Untuk sampel tanah, 1gr sampel tanah dilarutkan dalam 10 ml aquades ditambah larutan fisiologis 1, kemudian dilakukan pengenceran sampai diperoleh larutan dengan pengenceran 10 -8 . Masing-masing seri pengenceran diambil 10 l dan diinokulasikan pada media Luria Bertani LB padat yang terdiri dari: 1 tripton, 0,5 yeast, 1 NaCl, dan 2 bacto agar, yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Koloni tunggal yang tumbuh pada media LB selanjutnya dimurnikan dengan cara melakukan subkultur beberapa kali.

2. Seleksi bakteri penghasil fitase

Koloni tunggal yang diperoleh kemudian diinokulasikan pada media seleksi padat yang terdiri dari 2,5 bekatul, 0,5 yeast, 1 NaCl, 0,25 glukosa, dan 2 bacto agar. Bakteri diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Bakteri yang dapat tumbuh pada media tersebut berarti memiliki kemampuan aktivitas fitase karena bakteri tersebut mampu menghidrolisis fitat pada bekatul. Penggunaan bekatul sebagai bahan dalam media seleksi mengacu pada penelitian Rosmimik et al ., 1998, bahwa Bacillus coagulans EI.4.4 yang menghasilkan fitase mampu menghidrolisis fitat pada bekatul. Bakteri kemudian di subkulturkan lagi pada media LB padat tanpa bekatul, lalu dipindahkan ke media LB cair. commit to user 21

3. Penentuan aktivitas fitase

Satu ml kultur hasil seleksi pada LB cair kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh kemudian ditentukan aktivitas fitasenya. Penentuan aktivitas fitase dilakukan dengan metode Sajidan 2002, yaitu dengan 150 l filtrat enzim + 750l substrat 0,4 Na-fitat dalam 0,82 larutan Na-asetat pada pH 5 yang diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1 jam. Kemudian reaksi dihentikan dengan penambahan 2400 l larutan stop yang terdiri dari larutan Amonium molibdat 2,352 g Ammonium molibdat + 2 ml HNO 3 + 100 ml aquades, HNO 3 , aquades, dan 10 Amonium metavanadat dengan perbandingan 1,5 : 1 : 2 : 1,5. Absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 415 nm. Dari data absorbansi tersebut kemudian dihitung besarnya aktivitas relatif, yaitu: �� = OD X −OD kontrol OD �−�� �� x 100 dimana: ODx = absorbansi sampel uji ODα = absorbansi tertinggi Penentuan uji aktivitas fitase dilakukan dengan mengukur kadar fosfat yang dihasilkan selama terjadi reaksi enzimatis yaitu ekstrak kasar fitase yang diinkubasikan selama 1 jam pada substrat yang mengandung natrium fitat dan natrium asetat. Reaksi enzimatis kemudian dihentikan dengan menambahakan larutan Stop asam vanadomolibdofosforik, kemudian diukur nilai absorbansinya dan dikalibrasikan dengan larutan standar sehingga menghasilkan nilai aktivitas fitase dalam satuan Uml, yang berarti jumlah μmol PO 4 -3 yang dilepas per menit per mililiter enzim. Perhitungan besarnya aktivitas fitase dilakukan dengan cara commit to user 22 memasukkan data nilai absorbansi terkoreksi Lampiran 2-8 ke dalam persamaan linear hasil dari kurva standar KH 2 PO 4 Lampiran 1. Tiga isolat bakteri yang memiliki aktivitas fitase tertinggi kemudian enzimnya dikarakterisasi lebih lanjut yang meliputi optimalisasi suhu fitase, optimalisasi pH fitase, stabilitas suhu dan pH fitase, dan pengaruh ion logam terhadap aktivitas fitase.

4. Karakterisasi ekstrak kasar fitase

Karakterisasi ekstrak kasar fitase meliputi penentuan suhu optimum fitase, pH optimum fitase, stabilitas suhu dan pH fitase, dan pengaruh ion logam terhadap aktivitas fitase. Penentuan suhu optimum fitase dilakukan dengan cara menentukan aktivitas enzim pada rentang suhu 30-90 ºC, sedangkan penentuan pH optimum fitase dilakukan dengan cara menentukan aktivitas enzim pada rentang pH 3-9. Penentuan stabilitas suhu fitase dilakukan dengan cara memanaskan enzim pada suhu optimumnya pada selang waktu tertentu dan ditentukan aktivitasnya sampai enzim tidak memperlihatkan aktivitas secara signifikan. Penentuan stabilitas pH fitase dilakukan dengan cara melarutkan enzim dalam larutan buffer dengan berbagai pH 3-9. Masing-masing reaksi diinkubasi pada suhu optimum selama 1 jam. Kemudian dilakukan penentuan aktivitas enzim pada pH optimum dan suhu optimum. Penentuan pengaruuh ion logam terhadap aktivitas fitase dilakukan pada kondisi pH dan suhu optimum fitase. Ion logam yang digunakan berasal dari commit to user 23 garam ZnCl 2 , FeCl 2 , MgCl 2 dan CaCl 2 , masing-masing dengan konsentrasi 10 -3 M. 150 l enzim + 750l substrat + 30l efektor logam diinkubasi pada suhu dan pH optimum fitase selama 1 jam, kemudian ditentukan aktivitasnya.

5. Identifikasi isolat terpilih

Setelah diperoleh koloni tunggal, isolat bakteri yang memiliki aktivitas fitase tertinggi selanjutnya diidentifikasi berdasarkan karakter morfologi dan analisis gen 16S rRNA.

a. Pewarnaan gram

Gelas benda ditetesi dengan aquades, kemudian mengambil biakan bakteri dengan jarum ose dan meletakkan diatas aquades, lalu difiksaasi diatas nyala api bunsen. Setelah mengering kemudian ditetesi dengan 1 tetes kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit dan dibilas dengan aquades. Ditetesi dengan 1 tetes iodin dan dibiarkan selama 30 detik kemudian dibilas dengan alkohol. Ditetesi dengan 1 tetes safranin dan dibiarkan selama 30 detik kemudian dibilas dengan aquades. Bakteri diamati di bawah mikroskop. Warna ungu pada sel menunjukkan bakteri gram positif, sedangkan warna merah menunjukkan bakteri gram negatif.

b. Isolasi DNA bakteri

Isolat bakteri yang memiliki aktivitas fitase tertinggi ditumbuhkan dalam medium LB cair, kemudian DNA diekstrak dengan menggunakan kit ekstraksi DNA dari Promega. commit to user 24 Tahapan ekstraksi DNA dimulai dari mensentrifuge 1ml kultur cair dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit, kemudian supernatant dipindahkan. Pelet ditambahkan dengan 480  l larutan EDTA dan 120  l larutan lisis, kemudian dikocok. Menambahkan 60  l Lisozym lalu diinkubasikan pada suhu 37ºC selama 1 jam. Larutan disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit, kemudian supernatant dibuang. Pellet ditambahkan dengan 600  l larutan lisis nukleus kemudian diinkubasikan pada suhu 80ºC selama 5 menit, kemudian pindahkan ke suhu ruang. Menambahkan 3  l RNAase pada larutan, lalu dikocok dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1 jam. Menambahkan 200  l larutan presipitasi protein, divorteks selama 20 detik dengan kecepatan tinggi, kemudian diinkubasikan pada es selama 5 menit. Larutan disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit, supernatan dipindahkan ke tube baru yang telah berisi dengan 600  l isopropanol, kocok sampai terlihat masa strand DNA. Sentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Buang supernatant, lalu keringkan. Menambahakan 600  l etanol 70, kemudian dikocok dan disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Kering anginkan tube selama 15-60 menit, kemudian tambahkan 100  l DNA rehydration . Inkubasikan pada suhu 65ºC selama 1 jam, kocok secara berkala, dan yang terakhir simpan DNA pada suhu 4ºC. Kualitas DNA diketahui melalui spektofotometer, dan kemurnian DNA dicek melalui elektroforesis pada agarose gel 1. commit to user 25

c. Amplifikasi DNA

Amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR universal primer, dengan primer forward 27 f 5’ GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’, dan primer reverse 765r 5’ CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC 3’ Sajidan, 2004. Reaksi PCR terdiri dari 12,5 l master mix PCR Gotaq green, 2l DNA, 0,5 l primer f, 0,5 l primer r, dan 9,5 l ddH 2 O, sehingga total volumenya adalah 25 l. Siklus PCR meliputi 3 tahap yaitu: denaturasi, anneling , dan extention , dilakukan sebanyak 30 siklus. Denaturasi awal pada suhu 94ºC selama 2 menit, dilanjut dengan 30 siklus dengan denaturasi pada suhu 94ºC selama 1 menit, anneling pada suhu 58ºC selama 45 detik, extention pada suhu 72ºC selama 90 detik, kemudian extra extention pada suhu 72ºC selama 5 menit, yang terakhir disimpan pada suhu 4ºC. Pita DNA hasil PCR diamati dengan agarose gel 1, diletakkan pada marka 1kb, kemudian dilakukan sequencing di Laboratorium 1 st Base Singapura.

E. Analisis Data

Data yang diperoleh dari uji aktivitas fitase adalah jumlah kandungan fosfat anorganik yang dihasilkan ketika terjadi rekasi enzimatis antara ekstrak kasar fitase dengan substrat yang mengandung asam fitat. Satu unit aktivitas enzim fitase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis reaksi yang menghasilkan 1 mol fosfat organik per menit pada kondisi optimum. Penentuan konsentrasi fosfat anorganik dilakukan dengan menggunakan ammonium molibdat-vanadat, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan commit to user 26 spektrofotometer UV-VIS. Untuk pembuatan kurva kalibrasi digunakan larutan KH 2 PO 4 dengan konsentrasi 100 –1000 ppm. Tiga isolat bakteri yang memiliki aktivitas fitase terbesar kemudian diidentifikasi dan dikarakterisasi enzimnya lebih lanjut. Data karakterisasi enzim meliputi: suhu optimum fitase, pH optimum fitase, stabilitas suhu dan pH fitase, dan pengaruh ion logam terhadap aktivitas fitase dianalisis secara deskriptif kualitatif. Data yang diperoleh pada identifikasi morfologi isolat terpilih berupa bentuk dan warna koloni, bentuk sel serta pewarnaan gram juga dianalisis secara deskriptif kualitatif. Tiga isolat bakteri dengan aktivitas fitase tertinggi dianalisis berdasarkan gen penyandi 16S rRNA. Hasil sekuensing diperoleh susunan basa nukleotida yang diolah dengan program Bio Edit dan Peak Trace untuk mendapatkan sekuens alignment yang baik. Kemiripan sekuens DNA sampel dengan sekuens yang ada di gen bank dicari dengan menggunakan program BLASTn NCBI www.ncbi.nlm.nih.govblastBlast.cgi , penjajaran urutan basa nukleotida dari beberapa sekuen menggunakan multiple sequen alignment dari program ClustalW www.genome.jptoolsclustalw dan konstruksi pohon filogenetik dibuat dengan menggunakan program ClustalW yang sama. commit to user 27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Bakteri dari kawah Sikidang Dieng

Isolasi dari sampel air diperoleh 104 koloni bakteri, sedangkan isolasi dari sampel lumpur diperoleh 30 koloni bakteri. Isolat bakteri yang berasal dari sampel lumpur memiliki morfologi yang setipe dengan isolat bakteri yang berasal dari sampel air, hanya saja jumlah isolat bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi lebih banyak yang berasal dari sampel air. Ketersediaan oksigen di dalam air lebih besar daripada di dalam lumpur, sehingga bakteri lebih cepat berkembangbiak di dalam air. Oleh karenanya isolat bakteri lebih banyak ditemukan dalam sampel air kawah daripada dalam sampel lumpur kawah. Dilihat secara morfologi, ada tipe koloni bakteri yang memiliki permukaan mengkilat dan tampak licin, permukaan tidak mengkilat, tepi rata halus, tepi bergelombang, tepi bergerigi, koloni tebal, dan koloni tipis Gambar 13. Dari 134 isolat bakteri tersebut kemudian dikelompokkan sementara berdasarkan bentuk morfologi yang nampak, kemudian diambil beberapa isolat yang mewakili untuk dilakukan seleksi fitase. Gambar 13. a, b, c. Koloni bakteri yang tumbuh pada media LB padat.