Pewarnaan gram Isolasi DNA bakteri

commit to user 23 garam ZnCl 2 , FeCl 2 , MgCl 2 dan CaCl 2 , masing-masing dengan konsentrasi 10 -3 M. 150 l enzim + 750l substrat + 30l efektor logam diinkubasi pada suhu dan pH optimum fitase selama 1 jam, kemudian ditentukan aktivitasnya.

5. Identifikasi isolat terpilih

Setelah diperoleh koloni tunggal, isolat bakteri yang memiliki aktivitas fitase tertinggi selanjutnya diidentifikasi berdasarkan karakter morfologi dan analisis gen 16S rRNA.

a. Pewarnaan gram

Gelas benda ditetesi dengan aquades, kemudian mengambil biakan bakteri dengan jarum ose dan meletakkan diatas aquades, lalu difiksaasi diatas nyala api bunsen. Setelah mengering kemudian ditetesi dengan 1 tetes kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit dan dibilas dengan aquades. Ditetesi dengan 1 tetes iodin dan dibiarkan selama 30 detik kemudian dibilas dengan alkohol. Ditetesi dengan 1 tetes safranin dan dibiarkan selama 30 detik kemudian dibilas dengan aquades. Bakteri diamati di bawah mikroskop. Warna ungu pada sel menunjukkan bakteri gram positif, sedangkan warna merah menunjukkan bakteri gram negatif.

b. Isolasi DNA bakteri

Isolat bakteri yang memiliki aktivitas fitase tertinggi ditumbuhkan dalam medium LB cair, kemudian DNA diekstrak dengan menggunakan kit ekstraksi DNA dari Promega. commit to user 24 Tahapan ekstraksi DNA dimulai dari mensentrifuge 1ml kultur cair dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit, kemudian supernatant dipindahkan. Pelet ditambahkan dengan 480  l larutan EDTA dan 120  l larutan lisis, kemudian dikocok. Menambahkan 60  l Lisozym lalu diinkubasikan pada suhu 37ºC selama 1 jam. Larutan disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit, kemudian supernatant dibuang. Pellet ditambahkan dengan 600  l larutan lisis nukleus kemudian diinkubasikan pada suhu 80ºC selama 5 menit, kemudian pindahkan ke suhu ruang. Menambahkan 3  l RNAase pada larutan, lalu dikocok dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1 jam. Menambahkan 200  l larutan presipitasi protein, divorteks selama 20 detik dengan kecepatan tinggi, kemudian diinkubasikan pada es selama 5 menit. Larutan disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit, supernatan dipindahkan ke tube baru yang telah berisi dengan 600  l isopropanol, kocok sampai terlihat masa strand DNA. Sentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Buang supernatant, lalu keringkan. Menambahakan 600  l etanol 70, kemudian dikocok dan disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Kering anginkan tube selama 15-60 menit, kemudian tambahkan 100  l DNA rehydration . Inkubasikan pada suhu 65ºC selama 1 jam, kocok secara berkala, dan yang terakhir simpan DNA pada suhu 4ºC. Kualitas DNA diketahui melalui spektofotometer, dan kemurnian DNA dicek melalui elektroforesis pada agarose gel 1. commit to user 25

c. Amplifikasi DNA