Pengayaan dan pemurnian mikroorganisme Seleksi bakteri penghasil fitase Penentuan aktivitas fitase

commit to user 20

D. Prosedur Penelitian

1. Pengayaan dan pemurnian mikroorganisme

Satu ml air sampel ditambahkan dengan 9 ml larutan fisiologis, dan dilakukan pengenceran sampai diperoleh larutan dengan pengenceran 10 -8 . Untuk sampel tanah, 1gr sampel tanah dilarutkan dalam 10 ml aquades ditambah larutan fisiologis 1, kemudian dilakukan pengenceran sampai diperoleh larutan dengan pengenceran 10 -8 . Masing-masing seri pengenceran diambil 10 l dan diinokulasikan pada media Luria Bertani LB padat yang terdiri dari: 1 tripton, 0,5 yeast, 1 NaCl, dan 2 bacto agar, yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Koloni tunggal yang tumbuh pada media LB selanjutnya dimurnikan dengan cara melakukan subkultur beberapa kali.

2. Seleksi bakteri penghasil fitase

Koloni tunggal yang diperoleh kemudian diinokulasikan pada media seleksi padat yang terdiri dari 2,5 bekatul, 0,5 yeast, 1 NaCl, 0,25 glukosa, dan 2 bacto agar. Bakteri diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Bakteri yang dapat tumbuh pada media tersebut berarti memiliki kemampuan aktivitas fitase karena bakteri tersebut mampu menghidrolisis fitat pada bekatul. Penggunaan bekatul sebagai bahan dalam media seleksi mengacu pada penelitian Rosmimik et al ., 1998, bahwa Bacillus coagulans EI.4.4 yang menghasilkan fitase mampu menghidrolisis fitat pada bekatul. Bakteri kemudian di subkulturkan lagi pada media LB padat tanpa bekatul, lalu dipindahkan ke media LB cair. commit to user 21

3. Penentuan aktivitas fitase

Satu ml kultur hasil seleksi pada LB cair kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh kemudian ditentukan aktivitas fitasenya. Penentuan aktivitas fitase dilakukan dengan metode Sajidan 2002, yaitu dengan 150 l filtrat enzim + 750l substrat 0,4 Na-fitat dalam 0,82 larutan Na-asetat pada pH 5 yang diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1 jam. Kemudian reaksi dihentikan dengan penambahan 2400 l larutan stop yang terdiri dari larutan Amonium molibdat 2,352 g Ammonium molibdat + 2 ml HNO 3 + 100 ml aquades, HNO 3 , aquades, dan 10 Amonium metavanadat dengan perbandingan 1,5 : 1 : 2 : 1,5. Absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 415 nm. Dari data absorbansi tersebut kemudian dihitung besarnya aktivitas relatif, yaitu: �� = OD X −OD kontrol OD �−�� �� x 100 dimana: ODx = absorbansi sampel uji ODα = absorbansi tertinggi Penentuan uji aktivitas fitase dilakukan dengan mengukur kadar fosfat yang dihasilkan selama terjadi reaksi enzimatis yaitu ekstrak kasar fitase yang diinkubasikan selama 1 jam pada substrat yang mengandung natrium fitat dan natrium asetat. Reaksi enzimatis kemudian dihentikan dengan menambahakan larutan Stop asam vanadomolibdofosforik, kemudian diukur nilai absorbansinya dan dikalibrasikan dengan larutan standar sehingga menghasilkan nilai aktivitas fitase dalam satuan Uml, yang berarti jumlah μmol PO 4 -3 yang dilepas per menit per mililiter enzim. Perhitungan besarnya aktivitas fitase dilakukan dengan cara commit to user 22 memasukkan data nilai absorbansi terkoreksi Lampiran 2-8 ke dalam persamaan linear hasil dari kurva standar KH 2 PO 4 Lampiran 1. Tiga isolat bakteri yang memiliki aktivitas fitase tertinggi kemudian enzimnya dikarakterisasi lebih lanjut yang meliputi optimalisasi suhu fitase, optimalisasi pH fitase, stabilitas suhu dan pH fitase, dan pengaruh ion logam terhadap aktivitas fitase.

4. Karakterisasi ekstrak kasar fitase