kebenarannya menggunakan acuan baku Backer dan Backuizen van den Brink, 1965.
2. Pengumpulan daun mimba
Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada
bulan Juni 2006.
3. Sterilisasi alat dan bahan
Sterilisasi alat dilakukan untuk menghilangkan mikroorganisme dari alat-alat yang akan digunakan agar tidak mengganggu penelitian. Adapun metode
sterilisasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode uap panas dengan menggunakan autoklaf. Alat–alat gelas yang akan digunakan dalam keadaan
steril, dicuci sampai bersih kemudian di sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 20 menit.
4. Preparasi fraksi protein dari daun mimba
Daun tanaman mimba dikumpulkan segar, diseleksi, dibersihkan tulang daunnya, dan ditimbang sebanyak 400 gram. Daun kemudian dicuci bersih dengan
air mengalir, dibungkus plastik dan disimpan dalam freezer semalam. Bahan ditumbuk halus dalam mortir bersih dan steril dengan penambahan sedikit demi
sedikit dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu dingin dengan penambahan es di sekitarnya. Bahan diperas dan disaring
dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifus dengan 4000 rpm selama 30 menit. Supernatan
yang diperoleh merupakan ekstrak gubal, dikumpulkan dalam beker glass dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
diukur volumenya. Supernatan ekstrak gubal yang diperoleh, diendapkan proteinnya dengan menambahkan amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan
30. Penambahan amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit, diikuti pengadukan teratur dengan magnetic stirrer pada suhu dingin, dilanjutkan dengan
sentrifugasi ultra dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 4°C selama 25 menit. Supernatan 1 ditampung dalam labu ukur sedangkan endapan yang diperoleh
dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya endapan tadi didialisis dengan memasukkan larutan endapan dalam
dapar natrium fosfat ke dalam membran dialisis yang salah satu ujungnya telah dijepit dengan penjepit khusus membran kemudian ujung membran yang lainnya
ditutup dengan dijepit dengan penjepit khusus membran dengan kuat. Membran dialisis lalu digantung dalam bekerglass yang berisi dapar natrium fosfat 5 mM
pH 7,2 sebanyak 1000 ml. Proses dialisis dilakukan dalam almari es selama semalam dengan di-stirrer perlahan dan dilakukan penggantian dapar natrium
fosfat satu kali. Hasil dialisis disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit. Endapan hasil dialisis dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini
merupakan sampel fraksi protein daun mimba dengan konsentrasi amonium sulfat 30 jenuh.
Supernatan 1, 2, dan 3 ditampung secara bertahap, kemudian ditambah amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 40, 50, 60 dengan
menggunakan langkah- langkah yang sama dengan konsentrasi 10 jenuh. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kategori