jenuh dari kadar jenuh adalah sebanyak 28,35 gram; 29,29 gram; 30,29 gram; 31,36 gram.
D. Pengukuran Kadar Protein dengan Spektrofotometri UV
Sampel fraksi-fraksi protein daun mimba yang diperoleh kemudian diukur kadarnya dengan menggunakan metode spektrofotometer UV dengan kuvet
kuarsaglass. Panjang gelombang yang digunakan ialah 280 nm dan 260 nm. Digunakan panjang gelombang 280 nm karena protein dapat menyerap secara
aktif dan memberi respon maksimal pada panjang gelombang tersebut. Umumnya protein mengandung residu asam amino seperti tirosin, triptofan dan fenilalanin di
mana residu-residu asam amino tersebut mempunyai cincin aromatis yang mengandung kromofor atau juga auksokrom sehingga dapat menyerap sinar UV.
Untuk mengoreksi adanya senyawa-senyawa yang juga dapat mengabsorbsi pada panjang gelombang tersebut maka pengukuran juga dilakukan pada panjang
gelombang 260 nm. Metode ini kurang tepat karena terganggu oleh adanya asam nukleat serta senyawa yang mengandung cincin pirimidin dan purin yang
mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 260 nm. Oleh karena itu, dalam perhitungan kadar protein dengan metode ini perlu dilakukan koreksi
yakni dengan mengalikan absorbansi pada panjang gelombang 280 nm dengan faktor koreksi dan faktor pengenceran. Hasil pengukuran konsentrasi protein FP
30
, FP
40
, FP
50
, FP
60
berturut-turut adalah 15,95 mgml; 9,25 mgml; 15,20 mgml; 35,30 mgml.
Tabel I. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometer UV dan rasio serapan pada panjang gelombang 280 nm
dan 260 nm Absorbansi pada
280 nm
Absorbansi pada
260 nm
Konsentrasi Fraksi protein daun
mimbamgml
-1
0,223 0,245 15,95
0,195 0,276 9,25
0,203 0,214 15,20
0,542 0,641 35,30
E. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba
Uji sitotoksisitas yang dilakukan dalam penelitian ini merupakan uji sitotoksisitas secara in vitro. Pengujian dilakukan dengan cara memberikan
perlakuan fraksi protein daun mimba FP
30
, FP
40
, FP
50
, FP
60
pada kultur sel SiHa dan sel Vero.
Pada penelitian ini dilakukan pengamatan morfologi sel SiHa dan sel Vero untuk mengetahui adanya perbedaan morfologi sel yang dikenai perlakuan dan
tidak dikenai perlakuan.
sel SiHa sel Vero
Gambar 1. Sel SiHa dan Sel Vero tanpa perlakuan
Gambar 2. Kultur sel SiHa yang diberi Gambar 3. Kultur sel Vero yang diberi
perlakuan fraksi protein daun mimba perlakuan fraksi protein daun mimba
keterangan: i sel SiHa yang hidup keterangan : i sel Vero yang hidup
ii sel SiHa yang mati ii sel Vero yang mati
Sel SiHa yang hidup tampak berbentuk panjang dan menempel pada flask. Sel SiHa yang mati tampak berbentuk bulat, berukuran lebih kecil, dan tidak
menempel pada flask. Sel Vero yang hidup tampak berbentuk lonjong dan menempel pada dasar flask. Sedangkan sel Vero yang mati tampak berbentuk
bulat dan tidak menempel pada dasar flask. Metode uji sitotoksisitas yang digunakan dalam penelitian ini adalah
metode MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Prinsip dari metode MTT adalah adanya pemecahan garam tetrazolium MTT 3-
4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-dipheniltetrazolium bromid oleh sistem enzim reduktase suksinat tetrazolium yang terdapat di dalam mitokondria sel sehingga
terbentuklah kristal formazan berwarna ungu yang tidak larut. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
N N
N N
S N
CH
3
CH
3
NH N
N N
S N
CH
3
CH
3
NADH
NAD
+
MTT Formazan
Br
Gambar 4. Reaksi Pembentukan Kristal Formazan
Kristal formazan ini bersifat tidak larut air. Penambahan detergen
natrium dodesil sulfat 10 yang terdapat dalam stopper reagent, akan menyebabkan kristal formazan larut. Intensitas warna ungu yang terbentuk dapat
dibaca dengan ELISA reader. Jumlah sel hidup berbanding lurus dengan intensitas warna dari formazan yang terbentuk.
Gambar 5. Kristal Formazan di Bawah Mikroskop
Metode MTT ini termasuk metode yang cukup akurat karena absorbansi yang terbaca sebanding dengan jumlah sel hidup yang masih aktif melakukan
metabolisme. Selain itu, uji ini juga dirasa cukup aman, sederhana, dan cepat. Aman karena tidak memerlukan penggunaan zat-zat yang berbahaya, sederhana
karena perlakuan yang harus diberikan pada sampel sebelum diuji relatif cukup PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kategori