5. Definisi operasional a.
sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari fraksi protein daun mimba terhadap sel SiHa dan sel Vero.
b.fraksi protein ialah fraksi protein daun mimba Azadirachta indica A.
Juss. FP
30
, FP
40
, FP
50
, dan FP
60
, dinyatakan dalam µgml. c.
LC
50
ialah konsentrasi fraksi protein daun mimba yang mampu membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50 sel uji dan dinyatakan dalam
µgml.
C. Alat dan Bahan 1.
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas, stamper, mortir, timbangan analitik AND ER-400 H, alumunium foil, magnetic
stirrer, tabung conical, autoklaf, tissue culture flask, swing rotor sentrifuge PLC, inkubator Nuaire, mikropipet, membran dialisis Sigma, lemari
pendingin, cell counter Nunc, 96-well plate Nunc, spektrofotometer UV Cecil CE-292, ELISA reader SLT 340 ATC, laminar air flow Nuaire, mikroskop
Olympus IMT-2, haemocytometer Nebauer, kain monel, tissue, glove, masker.
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah : a. daun mimba segar
b. kultur sel SiHa yang diambil dari persediaan di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
c. kultur sel Vero normal yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
d. pereaksi-peraksi yang digunakan untuk preparasi fraksi protein daun mimba
1 larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 Merck
2 larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14
M NaCl Merck 3
amonium sulfat p.a. Merck e.
Pereaksi-pereaksi untuk uji sitotoksisitas 1
media pencuci: RPMI 1640 Sigma, natrium bikarbonat, Hepes 2
media penumbuh: RPMI 1640, M199, FBS Foetal Bovine Serum 10, Penisilin-Streptomisin 1 Gibco, dan Fungison 0,5
Gibco. 3
reagen Stopper : SDS sodium dodeksil sulfat dalam HCl 0,01 N Merck
4 MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium
bromide Sigma
D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi
tanaman
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun mimba, telah dideterminasi terlebih dahulu di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia,
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kebenarannya menggunakan acuan baku Backer dan Backuizen van den Brink, 1965.
2. Pengumpulan daun mimba
Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada
bulan Juni 2006.
3. Sterilisasi alat dan bahan
Sterilisasi alat dilakukan untuk menghilangkan mikroorganisme dari alat-alat yang akan digunakan agar tidak mengganggu penelitian. Adapun metode
sterilisasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode uap panas dengan menggunakan autoklaf. Alat–alat gelas yang akan digunakan dalam keadaan
steril, dicuci sampai bersih kemudian di sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 20 menit.
4. Preparasi fraksi protein dari daun mimba
Daun tanaman mimba dikumpulkan segar, diseleksi, dibersihkan tulang daunnya, dan ditimbang sebanyak 400 gram. Daun kemudian dicuci bersih dengan
air mengalir, dibungkus plastik dan disimpan dalam freezer semalam. Bahan ditumbuk halus dalam mortir bersih dan steril dengan penambahan sedikit demi
sedikit dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu dingin dengan penambahan es di sekitarnya. Bahan diperas dan disaring
dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifus dengan 4000 rpm selama 30 menit. Supernatan
yang diperoleh merupakan ekstrak gubal, dikumpulkan dalam beker glass dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
