dalam inkubator dengan suhu 37
o
C dengan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya
cukup untuk penelitian. b. Panen Sel SiHa
Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari
dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai
volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian
dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x10
4
100 μl dan siap dipakai
untuk penelitian.
8. Propagasi dan panen sel Vero
a. Propagasi Sel Vero Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam
penangas air 37
o
C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70. Ampul dibuka dan sel SiHa dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium
M199. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium M199 yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel
lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang
mengandung 10 FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37
o
C dengan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya
cukup untuk penelitian. b. Panen sel Vero
Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, sel dicuci dengan FBS 10 sebanyak 3 ml. Untuk melepaskan sel-sel dari dinding flask,
diberi tripsin 2,5 sebanyak 1 ml. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan
FBS 10 sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang sama dan disentrifuse selama 5 menit. Untuk menghilangkan sisa tripsin, sel
dicuci sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya lakukan perhitungan jumlah
sel dengan menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x10
4
100 μl dan siap
dipakai untuk penelitian.
9. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel SiHa
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl suspensi sel SiHa dengan
kepadatan 2,5x10
4
100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate
yang telah berisi 100 μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 200 µgml pada
sumuran A
1
, B
1
dan C
1
pada kolom 1, kemudian pada sumuran A
2
, B
2
dan C
2
di kolom 2 ditambahkan 100
μl suspensi sel SiHa pada sumuran yang telah berisi 100
μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 100 µgml, demikian seterusnya PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi
medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sedangkan untuk faktor koreksi, 100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium
RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37
o
C, dalam inkubator dengan aliran 5 CO
2.
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl
MTT 2,5 μgml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu
37
o
C, dalam inkubator dengan aliran CO
2
5. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 50
μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar.
Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.
10. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl suspensi sel Vero dengan
kepadatan 2,5x10
4
100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate
yang telah berisi 100 μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 200 µgml pada
sumuran A
1
, B
1
dan C
1
pada kolom 1, kemudian pada sumuran A
2
, B
2
dan C
2
di kolom 2 ditambahkan 100
μl suspensi sel Vero pada sumuran yang telah berisi 100
μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 100 µgml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian.
Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
