Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero

yang bertujuan untuk menghilangkan pengotor-pengotor yang menempel pada daun, kemudian sampel disimpan di dalam freezer semalaman agar daun menjadi lebih kaku sehingga mudah dihaluskan. Daun ditumbuk sampai halus dengan menggunakan mortir yang dialasi dengan wadah yang berisi es sehingga tercipta suasana yang dingin di sekitar mortir. Pada saat penumbukan ditambahkan dapar natrium fosfat 5 mM yang mengandung NaCl. Dapar ini berfungsi untuk mengeluarkan atau mengekstraksi protein yang terdapat pada daun dan NaCl akan mempermudah proses ekstraksi tersebut sehingga protein dapat larut dan stabil di dalam buffer penggerak. Proses tersebut dilakukan pada suhu dingin supaya protein tidak rusak, karena jika dilakukan pada suhu tinggi protein akan mengalami denaturasi. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak gubal daun mimba yang kemudian ditambahkan amonium sulfat sampai mencapai kejenuhan 30. Penambahan amonium sulfat ini bertujuan untuk menarik air yang terdapat di dalam larutan sehingga akan terjadi penurunan kelarutan protein dan agregasi molekul protein yang menyebabkan protein terendapkan. Proses di atas disebut mekanisme salting out. Pada mekanisme salting out tersebut, penambahan amonium sulfat dilakukan secara sedikit demi sedikit agar dapat larut sempurna. Dari proses sentrifugasi akan diperoleh supernatan dan endapan. Supernatannya ditampung untuk digunakan pada proses preparasi sampel fraksi berikutnya, sedangkan endapan yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Endapan yang diperoleh didialisis dengan tujuan untuk menghilangkan amonium sulfat yang masih terikat dengan protein. Proses dialisis ini dapat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI berlangsung karena adanya perbedaan gradien konsentrasi yang besar di dalam dan di luar permukaan tubing dialysis sehingga memungkinkan terjadinya mekanisme difusi pasif. Konsentrasi amonium sulfat di dalam tubing dialysis yang lebih tinggi dibanding di luar tubing dialysis mengakibatkan amonium sulfat akan keluar dari dalam tubing dialysis dengan mekanisme difusi pasif. Selain karena adanya perbedaan gradien konsentrasi yang besar, tubing dialysis ini bersifat semipermeabel, yang memiliki pori yang hanya mengeluarkan partikel- partikel yang berukuran sekitar 15.000–20.000 Dalton sehingga partikel amonium sulfat yang berukuran lebih kecil daripada protein dapat keluar dari dalam tubing dialysis sedang protein yang merupakan makromolekul tetap tertinggal di dalam. Pengggantian dapar dilakukan dengan tujuan agar amonium sulfat yang keluar dari tubing dialysis dan berada dalam dapar tidak terlalu jenuh sehingga perbedaan gradien konsentrasi amonium sulfat yang di dalam dengan yang di luar permukaan tubing dialysis tetap besar dan dengan demikian mekanisme difusi pasif dapat terus berjalan. Endapan hasil dialisis dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini merupakan sampel fraksi protein daun mimba dengan konsentrasi amonium sulfat 30 jenuh. Pada preparasi sampel fraksi protein daun mimba konsentrasi amonium sulfat 40, 50 dan 60 jenuh langkah pengerjaannya sama seperti di atas, yaitu dengan menggunakan supernatan hasil pengendapan amonium sulfat. Jumlah gram amonium sulfat yang ditambahkan berturut- turut untuk sampel fraksi protein daun mimba dengan konsentrasi amonium sulfat 30, 40, 50 dan 60 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI