Gambar 5. Penentuan OT fenolik sampel
Operating Time OT yang diperoleh untuk larutan asam galat adalah 30 menit, ditandai dengan nilai absorbansi yang tetap gambar 5.
2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
a. Uji aktivitas antioksidan Meskipun telah diketahui dari sejumlah literatur Blois, 1958; Lu dan
Foo, 2000; Zhu et al., 2002 bahwa panjang gelombang serapan maksimum DPPH yaitu pada
517 nm, tetapi tetap perlu untuk dilakukan penentuan dikarenakan panjang gelombang serapan maksimum dapat mengalami perubahan pergeseran
dikarenakan perbedaan kondisi percobaan yang dilakukan. Perubahan tersebut dapat berupa perbedaan instrumen, waktu pengukuran, pelarut, iklim, maupun
individu yang melakukan penelitian. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan terhadap
larutan DPPH dalam pelarut metanol pada tiga konsentrasi, setelah sebelumnya divorteks. Scanning dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm. Hasilnya
0,24 0,26
0,28 0,3
0,32
20 40
60 80
A b
so rb
a n
si
waktu menit
OT fenolik sampel
300
diperoleh panjang gelombang serapan maksimum untuk penelitian ini adalah 515,7 nm. Selisih panjang gelombang ini dengan panjang gelombang maksimum
teoritis sebesar 1,3 nm, selisih nilai ini masih memenuhi selisih yang diperbolehkan dalam Farmakope Indonesia Edisi IV, yaitu kurang dari 2 nm.
Karena hal diatas, panjang gelombang maksimum yang diperoleh dapat digunakan dalam penelitian.
b. Penetapan kandungan fenolik total Dilakukan pula penentuan panjang gelombang serapan maksimum untuk
pengujian kandungan fenolik total. Scanning dilakukan pada tiga seri konsentrasi asam galat low, medium, dan high pada panjang gelombang 600-800 nm. Dari
hasil scanning diperoleh panjang gelombang maksimum untuk penentuan kandungan fenolik total adalah 750 nm. Hasil tersebut sesuai dengan panjang
gelombang maksimum teoritis dari kompleks molybdenum blue, yaitu 750 nm. Panjang gelombang maksimum merupakan faktor penting dalam analisis
menggunakan spektrofotometer UV-Vis karena pada panjang gelombang tersebut diperoleh serapan optimum dari suatu senyawa yang diukur. Selain itu, panjang
gelombang serapan maksimum dapat digunakan untuk identifikasi molekul yang bersifat karakteristik. Panjang gelombang serapan maksimum tidak bergantung
pada struktur senyawa melainkan pada gugus yang mengabsorbsi radiasi sinar UV-Vis, sehingga jika ada dua senyawa dengan spektra UV-Vis yang sama,
belum tentu keduanya adalah senyawa yang sama. Hal inilah yang menyebabkan
panjang gelombang maksimum digunakan sebagai data sekunder dalam analisis kualitatif.
Dalam analisis kuantitatif, pengukuran absorbansi selalu dilakukan pada panjang gelombang serapan maksimum dikarenakan perubahan absorbansi untuk
tiap perubahan konsentrasi adalah paling besar sehingga memberikan kepekaan analisis yang tinggi. Selain itu, bila dilakukan pengukuran pada panjang
gelombang serapan maksimum maka untuk pengukuran berulang hasilnya lebih reprodusibel sehingga kesalahan yang terjadi makin kecil Mulja dan
Suharman,1995.
F. Validasi Metode Analisis Aktivitas Antioksidan Validasi metode analisis adalah suatu penilaian terhadap parameter
tertentu berdasarkan percobaan di laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan yang digunakan Harmita, 2004.
Validasi metode analisis perlu dilakukan baik untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH maupun penetapan kandungan fenolik total dengan metode
Folin-Ciocalteu. Parameter validasi yang dinilai meliputi presisi, linearitas serta
spesifisitas pengukuran.
Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi seri baku rutin yang direaksikan dengan DPPH
Dilihat dari data persamaan regresi linear seri baku rutin yang di atas, dipilih persamaan dari hasil replikasi, yaitu y =1,7697x + 5,8873-yang akan
digunakan untuk menghitung nilai dan presisi Coefficient of variation dari rutin. Dipilih persamaan tersebut karena nilai r dari replikasi menghasilkan nilai yang
paling mendekati 1 atau -1, yaitu r = 0,9965. Replikasi Rutin
Absorbansi Kontrol
Absorbansi IC Persamaan Regresi
Linier 1 11,53
0,882 0,650
26,30 y = 1,5296x + 14,693
r = 0,9957 18,77
0,537 39,12
27,29 0,404
54,20 34,92
0,285 67,69
39,66 0,211
76,08 2 12,11
0,897 0,652
27,31 y = 1,7328x + 7,8707
r = 0,9953 20,23
0,523 41,69
28,23 0,396
55,85 34,09
0,303 66,22
39,45 0,218
75,70 3 11,27
0,863 0,640
25,84 y = 1,7697x + 5,8873
r = 0,9965 19,72
0,511 40,79
27,36 0,394
54,35 33,54
0,300 65,24
39,36 0,211
75,55
Tabel II. Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit buah jeruk purut yang direaksikan dengan DPPH
Replikasi 1 Replikasi 2
Replikasi 3 Konsentrasi
Fraksi µg2mL
Absorbansi Konsentrasi
Fraksi µg2mL
Absorbansi Konsentrasi
Fraksi µg2mL
Absorbansi 302
0,664 300
0,675 300
0,683 600
0,540 604
0,542 604
0,545 904
0,414 902
0,421 900
0,430 1200
0,324 1204
0,328 1202
0,333 1508
0,230 1500
0,232 1506
0,235 Persamaan regresi linear
y = 0,00036x+ 0,7569 r = 0,9968
Persamaan regresi linear y =0,00037x + 0,7696
r = 0,9967 Persamaan regresi linear
y =0,000369x + 0,7776 r = 0,9971
Berdasarkan tabel II dari tiga replikasi fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit buah jeruk purut yang dilakukan dipilih persamaan replikasi tiga, yaitu y =
0,000369x + 0,7776 ; r = 0,9971 sebagai persamaan yang akan digunakan untuk menghitung coefficient of variation CV untuk fraksi etil asetat ekstrak etanol
kulit buah jeruk purut.
1. Presisi
