dan Makanan RI, 1995; Laboratoire, 2009. Washbensin digunakan untuk menghilangkan senyawa-senyawa yang tidak diinginkan yg bersifat nonpolar
seperti lipid, klorofil, dll. Setelah didapatkan fraksi air kemudian dilakukan ekstraksi cair menggunakan etil asetat, pada ekstraksi ini dilakukan pengulangan 3
kali yang bertujuan mengoptimalkan senyawa fenolik yang terekstraksi pada fase etil asetat. Setelah semua fraksi etil asetal di dapatkan kemudian diuapkan pelarut
dengan vacum evaporator, setelah hampir menguap secara keseluruhan ekstrak ditampung dalam cawan porselen kemudian di oven hingga bobot konstan pada
suhu 50ºC. Rendemen yang di dapat berupa ekstrak kental berwarna coklat kehitaman.
D. Hasil Uji Pendahuluan Uji pendahuluan ini dilakukan untuk mengetahui apakah dalam fraksi etil
asetat ekstrak etanolik kulit jeruk purut terdapat kandungan senyawa fenolik serta apakah fraksi tersebut memiliki aktivitas antioksidan. Pada uji pendahuluan
keberadaan senyawa fenolik, senyawa uji ditambahkan pereaksi fenol Folin- Ciocalteu, didiamkan selama dua menit kemudian ditambahkan larutan natrium
karbonat 1M. Pembanding yang digunakan untuk uji ini adalah asam galat yang
merupakan senyawa fenolik.
Gambar 1. Hasil uji pendahuluan fenolik A = kontrol negatif [blanko reagen fenol Folin-Ciocalteu], B = larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak
etanol kulit buah jeruk purut] + reagen Folin-Ciocalteu, C = kontrol positif [asam galat] + reagen Folin-Ciocalteu
Adanya senyawa fenolik dalam fraksi uji akan mengubah warna larutan menjadi biru. Perubahan warna tersebut terjadi karena oksidasi senyawa fenol
dalam fraksi uji oleh pereaksi Folin-Ciocalteu. Hasil pengujian pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik kulit buah jeruk menunjukkan positif terdapat kandungan
fenolik karena terbentuk warna biru, hal tersebut terjadi pula pada senyawa pembanding asam galat.
Pada uji pendahuluan aktivitas antioksidan, baik senyawa uji maupun senyawa pembanding, yaitu rutin ditambahkan pada larutan DPPH dalam
metanol. Adanya aktivitas antioksidan akan mengubah warna larutan DPPH yang semula berwarna ungu menjadi kekuningan. Hasil pengujian baik untuk senyawa
uji maupun senyawa pembanding semuanya positif karena terjadi perubahan warna pada
larutan DPPH dalam metanol menjadi kekuningan, dibandingkan dengan kontrol berupa larutan DPPH dalam metanol yang berwarna ungu.
Gambar 2. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan A = kontrol negatif [DPPH], B = kontrol positif [rutin], C = larutan uji [fraksi etil
asetat ekstrak etanol kulit buah jeruk purut] + DPPH
E. Optimasi Metode 1.
Penentuan operating time OT Penetuan operating time dimaksudkan untuk memperoleh waktu
pengukuran absorbansi dengan nilai yang stabil. Waktu pengukuran absorbansi
ditentukan saat warna yang terbentuk stabil, ditandai dengan nilai absorbansi
yang stabil dari senyawa yang diukur.
a. Uji aktivitas antioksidan. Penentuan operating time dilakukan dengan mengukur serapan larutan
DPPH yang telah ditambahkan senyawa uji maupun senyawa pembanding rutin pada tiga konsentrasi berbeda low, medium, dan high. Larutan divorteks dahulu
selama 30 detik sebelum diukur untuk menghomogenkan campuran tersebut agar bereaksi
optimal. Pembacaan
absorbansi dilakukan
menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis dari DPPH yaitu 517
nm selama 1 jam. Pengukuran absorbansi dilakukan tiap 5 menit dikarenakan instrumen yang digunakan tidak dapat digunakan untuk mengukur OT secara
otomatis.
Gambar 3. Kurva penentuan OT rutin
Operating time OT yang diperoleh untuk larutan pembanding rutin adalah 35 menit, ditandai dengan nilai absorbansi yang tetap gambar 3.
0,2 0,4
0,6 0,8
1
20 40
60 80
a b
so rb
a n
si
waktu t
Penentuan OT Rutin
12,25 µgmL 26,25 µgmL
40,25 µgmL
Gambar 4. Kurva penentuan OT sampel
Operating time OT yang diperoleh untuk larutan uji adalah 35 menit, ditandai dengan nilai absorbansi yang tetap gambar 4.
b. Penetapan kandungan fenolik total. Penentuan operating time dilakukan dengan mengukur serapan kompleks
molybdenum blue yang terbentuk oleh reaksi antara senyawa fenolik, yaitu asam galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dalam suasana basa. Pembacaan absorbansi
dilakukan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis kompleks molybdenum blue, yaitu 750 nm selama 30 menit. Pengukuran
absorbansi dilakukan tiap 5 menit dikarenakan instrumen yang digunakan tidak dapat digunakan untuk mengukur OT secara otomatis.
0,2 0,4
0,6 0,8
20 40
60 80
a b
so rb
a n
si
waktu menit
penentuan OT sampel
300 600
1500
Gambar 5. Penentuan OT fenolik sampel
Operating Time OT yang diperoleh untuk larutan asam galat adalah 30 menit, ditandai dengan nilai absorbansi yang tetap gambar 5.
2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
a. Uji aktivitas antioksidan Meskipun telah diketahui dari sejumlah literatur Blois, 1958; Lu dan
Foo, 2000; Zhu et al., 2002 bahwa panjang gelombang serapan maksimum DPPH yaitu pada
517 nm, tetapi tetap perlu untuk dilakukan penentuan dikarenakan panjang gelombang serapan maksimum dapat mengalami perubahan pergeseran
dikarenakan perbedaan kondisi percobaan yang dilakukan. Perubahan tersebut dapat berupa perbedaan instrumen, waktu pengukuran, pelarut, iklim, maupun
individu yang melakukan penelitian. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan terhadap
larutan DPPH dalam pelarut metanol pada tiga konsentrasi, setelah sebelumnya divorteks. Scanning dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm. Hasilnya
0,24 0,26
0,28 0,3
0,32
20 40
60 80
A b
so rb
a n
si
waktu menit
OT fenolik sampel
300
diperoleh panjang gelombang serapan maksimum untuk penelitian ini adalah 515,7 nm. Selisih panjang gelombang ini dengan panjang gelombang maksimum
teoritis sebesar 1,3 nm, selisih nilai ini masih memenuhi selisih yang diperbolehkan dalam Farmakope Indonesia Edisi IV, yaitu kurang dari 2 nm.
Karena hal diatas, panjang gelombang maksimum yang diperoleh dapat digunakan dalam penelitian.
b. Penetapan kandungan fenolik total Dilakukan pula penentuan panjang gelombang serapan maksimum untuk
pengujian kandungan fenolik total. Scanning dilakukan pada tiga seri konsentrasi asam galat low, medium, dan high pada panjang gelombang 600-800 nm. Dari
hasil scanning diperoleh panjang gelombang maksimum untuk penentuan kandungan fenolik total adalah 750 nm. Hasil tersebut sesuai dengan panjang
gelombang maksimum teoritis dari kompleks molybdenum blue, yaitu 750 nm. Panjang gelombang maksimum merupakan faktor penting dalam analisis
menggunakan spektrofotometer UV-Vis karena pada panjang gelombang tersebut diperoleh serapan optimum dari suatu senyawa yang diukur. Selain itu, panjang
gelombang serapan maksimum dapat digunakan untuk identifikasi molekul yang bersifat karakteristik. Panjang gelombang serapan maksimum tidak bergantung
pada struktur senyawa melainkan pada gugus yang mengabsorbsi radiasi sinar UV-Vis, sehingga jika ada dua senyawa dengan spektra UV-Vis yang sama,
belum tentu keduanya adalah senyawa yang sama. Hal inilah yang menyebabkan
panjang gelombang maksimum digunakan sebagai data sekunder dalam analisis kualitatif.
Dalam analisis kuantitatif, pengukuran absorbansi selalu dilakukan pada panjang gelombang serapan maksimum dikarenakan perubahan absorbansi untuk
tiap perubahan konsentrasi adalah paling besar sehingga memberikan kepekaan analisis yang tinggi. Selain itu, bila dilakukan pengukuran pada panjang
gelombang serapan maksimum maka untuk pengukuran berulang hasilnya lebih reprodusibel sehingga kesalahan yang terjadi makin kecil Mulja dan
Suharman,1995.
F. Validasi Metode Analisis Aktivitas Antioksidan Validasi metode analisis adalah suatu penilaian terhadap parameter
tertentu berdasarkan percobaan di laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan yang digunakan Harmita, 2004.
Validasi metode analisis perlu dilakukan baik untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH maupun penetapan kandungan fenolik total dengan metode
Folin-Ciocalteu. Parameter validasi yang dinilai meliputi presisi, linearitas serta
spesifisitas pengukuran.
Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi seri baku rutin yang direaksikan dengan DPPH
Dilihat dari data persamaan regresi linear seri baku rutin yang di atas, dipilih persamaan dari hasil replikasi, yaitu y =1,7697x + 5,8873-yang akan
digunakan untuk menghitung nilai dan presisi Coefficient of variation dari rutin. Dipilih persamaan tersebut karena nilai r dari replikasi menghasilkan nilai yang
paling mendekati 1 atau -1, yaitu r = 0,9965. Replikasi Rutin
Absorbansi Kontrol
Absorbansi IC Persamaan Regresi
Linier 1 11,53
0,882 0,650
26,30 y = 1,5296x + 14,693
r = 0,9957 18,77
0,537 39,12
27,29 0,404
54,20 34,92
0,285 67,69
39,66 0,211
76,08 2 12,11
0,897 0,652
27,31 y = 1,7328x + 7,8707
r = 0,9953 20,23
0,523 41,69
28,23 0,396
55,85 34,09
0,303 66,22
39,45 0,218
75,70 3 11,27
0,863 0,640
25,84 y = 1,7697x + 5,8873
r = 0,9965 19,72
0,511 40,79
27,36 0,394
54,35 33,54
0,300 65,24
39,36 0,211
75,55
Tabel II. Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit buah jeruk purut yang direaksikan dengan DPPH
Replikasi 1 Replikasi 2
Replikasi 3 Konsentrasi
Fraksi µg2mL
Absorbansi Konsentrasi
Fraksi µg2mL
Absorbansi Konsentrasi
Fraksi µg2mL
Absorbansi 302
0,664 300
0,675 300
0,683 600
0,540 604
0,542 604
0,545 904
0,414 902
0,421 900
0,430 1200
0,324 1204
0,328 1202
0,333 1508
0,230 1500
0,232 1506
0,235 Persamaan regresi linear
y = 0,00036x+ 0,7569 r = 0,9968
Persamaan regresi linear y =0,00037x + 0,7696
r = 0,9967 Persamaan regresi linear
y =0,000369x + 0,7776 r = 0,9971
Berdasarkan tabel II dari tiga replikasi fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit buah jeruk purut yang dilakukan dipilih persamaan replikasi tiga, yaitu y =
0,000369x + 0,7776 ; r = 0,9971 sebagai persamaan yang akan digunakan untuk menghitung coefficient of variation CV untuk fraksi etil asetat ekstrak etanol
kulit buah jeruk purut.
1. Presisi
Presisi merupakan keterulangan dari perolehan hasil analisis beberapa kali minimal 3 terhadap sampel yang dianalisis dengan metode yang digunakan.
Presisi dari metode analisis dinyatakan dalam Coeffisien of Variant CV. Persyaratan nilai CV yang baik untuk bahan p.a pada konsentrasi sekitar 10
ppm adalah 5 sedangkan nilai CV yang baik untuk bahan alam 15 Harmita, 2004.
Tabel III. Hasil presisi aktivitas antioksidan standar rutin
Konsentrasi µg2ml
Rerata konsentrasi
µg2ml Rerata
IC SD
CV
Seri1 11,64
26.48 0,425
3,651 Seri2
19,57 40,53
0,739 3,778
Seri3 27,63
54,78 0,525
1,899 Seri4
34,18 66,38
0,697 2,038
Seri5 39,49
75,77 0,151
0,383
Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukkan pada tabel III, Nilai ini masih masuk dalam persyaratan CV menurut Harmita 2004, di mana CV
yang baik adalah CV ≤ 5.
Tabel IV. Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat Konsentrasi
µg2ml Rerata
konsentrasi µg2ml
Rerata IC
SD CV
300 300,67
19,13 0,242
0,012 600
602,67 35,56
0,537 0,015
900 902,00
49,60 0,607
0,012 1200
1202,00 60,99
0,182 0,003
1500 1504,67
72,39 0,131
0,002
Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukkan pada tabel IV, didapat nilai CV berturut-turut 0,012; 0,015; 0,012; 0,003; 0,002
untuk lima konsentrasi sampel uji yang digunakan. Nilai ini masih masuk dalam persyaratan CV menurut Harmita 2004, dimana CV yang baik adalah CV
≤ 5
2. Linearitas
Linearitas pada suatu metode analisis dari suatu prosedur suatu analisis merupakan kemampuannya untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung
proporsional dengan konsentrasi jumlah analit di dalam sampel. Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung
berdasarkan persamaan data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Linearitas dinyatakan sebagai koefisien
korelasi r. Dalam penentuan kurva kalibrasi yang baik, konsentrasi minimal terdiri dari lima konsentrasi dengan jarak antara 50-150, sedangkan untuk
koefisien korelasi adalah 0,995 ataupun diharapkan lebih dari nilai tersebut Chan, Lam, Herman, Lee, 2004.
Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH
Replikasi Rutin
Absorbansi Kontrol
Absorbansi IC
Persamaan Regresi Linier
1 11,53 0,882
0,650 26,30
y = 1,5296x + 14,693 r = 0,9957
18,77 0,537
39,12 27,29
0,404 54,20
34,92 0,285
67,69 39,66
0,211 76,08
2 12,11 0,897
0,652 27,31
y = 1,7328x + 7,8707 r = 0,9953
20,23 0,523
41,69 28,23
0,396 55,85
34,09 0,303
66,22 39,45
0,218 75,70
3 11,27 0,863
0,640 25,84
y = 1,7697x + 5,8873 r = 0,99649
19,72 0,511
40,79 27,36
0,394 54,35
33,54 0,300
65,24 39,36
0,211 75,55
Gambar 6. Kurva persamaan regresi linear antioksidan rutin
Berdasar tiga hasil replikasi yang ditunjukan pada tabel V untuk validasi metode analisis rutin, didapatkan persamaan regresi linear untuk replikasi
satu y = 1,5296x + 14,693; replikasi dua y = 1,7328x + 7,8707 ; dan replikasi tiga y = 1,7697x + 5,8873. Dari tiga hasil tersebut nilai r yang dihasilkan masih
memenuhi persyaratan linearitas menurut Chan et al. 2005, di mana koefisien korelasi linearitas yang baik minimal r = 0,995. Hal ini menunjukkan bahwa
metode yang digunakan dalam analisis rutin mempunyai linearitas yang baik.
y = 1,7697x + 5,8873 r = 0,99649
0,00 20,00
40,00 60,00
80,00 100,00
10 20
30 40
50
I C
konsentrasi µgmL
Kurva Persamaan Regresi Linear Aktivitas Antioksidan Rutin
Tabel VI. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol dengan metode DPPH
Replikasi Konsentrasi
µg2mL IC
Persamaan regresi linier
302 20
y = 0,0433x+ 8,5231 r = 0,9966
600 34,94
I 904
50,32 1200
60,96 1508
72,29 300
20,1 y =0,0434x + 8,8617
r= 0,9969 604
35,86 II
902 50,18
1204 61,18
1500 72,54
300 19,64
y =0,0433x + 8,478 r= 0,9972
604 35,88
III 900
49,1 1202
60,82 1506
72,35
Gambar 7. Kurva persamaan regresi linear antioksidan fraksi etil asetat
Hasil dari persamaan regresi linier hasil dari tiga replikasi fraksi etil asetat ekstrak yang ditunjukan pada tabel VI, di dapatkan persamaan regresi
y = 0,043x + 8,478 r=0,9972
20 40
60 80
500 1000
1500 2000
A k
ti v
it a
s a
n ti
o k
si d
a n
konsentrasi
kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan fraksi etil asetat
linear berturut-turut adalah replikasi satu r = 0,9966; r = 0,9969, dan r = 0,9972. Tiga hasil ini masih diatas nilai koefisien korelasi linearitas minimal menurut
Chan, et al. 2005, yaitu r = 0,995. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan metode ini memiliki linieritas yang baik untuk menganalisis fraksi etil asetat ekstrak kulit
buah jeruk purut.
3. Spesifitas
Spesifitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya dapat mengukur senyawa tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya
komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel Harmita, 2004. Dalam metode analisis ini yang menggunakan spektrofotometri visibel pada pengukuran
rutin dan fraksi etil asetat sampel uji, spesifikasi metode dapat dilihat dengan tidak adanya serapan dari sampel sebelum ditambah DPPH pada panjang
gelombang pengukuran yang digunakan, yaitu 515,7 nm. Dari hasil spektra terlihat bahwa larutan rutin, larutan uji fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit buah
jeruk purut dan pelarut metanol tidak menunjukkan adanya gangguan berarti terhadap absorbansi DPPH hasil reaksi, dengan demikian dapat dikatakan metode
ini memilki spesifitas yang baik. Dari hasil validasi metode analisis yang dilakukan menunjukkan bahwa
metode penangkapan radikal bebas DPPH oleh rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit buah jeruk purut sebagai antioksidan terbukti sudah baik dalam,
presisi, spesifisitas dan linearitas sehingga hasil yang diperoleh dapat dipercaya.
G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH
Pada penelitian ini, pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH. Metode ini menggunakan senyawa radikal bebas, yaitu DPPH
karena terdapat elektron yang tidak berpasangan pada strukturnya sehingga dapat digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan suatu senyawa yang dapat
mendonorkan elektronnya sehingga terjadi penurunan intensitas warna atau absorbansi larutan DPPH. Dalam uji ini, rutin akan mereduksi radikal DPPH
menjadi senyawa 1,1 difenil-2-pikrilhidrazil sehingga terjadi penurunan intensitas warna pada larutan dari yang semula ungu menjadi kekuningan.
Gambar 8. Reaksi terbentuknya warna kuning dari DPPH oleh adanya antioksidan Molyneux, 2004
Pengurangan intensitas warna larutan DPPH tersebut dihasilkan oleh bereaksinya molekul radikal DPPH dengan satu atom hidrogen yang dilepaskan
komponen bahan uji sehingga terbentuk senyawa 1,1 difenil-2 pikrilhidrazil yang berwarna kuning. Pengurangan intensitas warna ungu larutan DPPH karena
adanya penambahan senyawa penangkap radikal bebas dapat dihitung secara kuantitatif dari berkurangnya absorbansi larutan tersebut.
Pada dasarnya absorbansi yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH yang tidak bereaksi dengan bahan uji atau DPPH yang masih tersisa dalam
campuran larutan, sehingga dengan bertambahnya konsentrasi senyawa penangkap radikal bebas dalam larutan, maka absorbansi larutan akan berkurang.
Hal ini berarti bahwa aktivitas penangkapan radikal bebasnya semakin meningkat. Menurut metode ini, aktivitas antioksidan dari senyawa uji dinyatakan
dengan IC
50
. Nilai IC
50
diperoleh dari persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi senyawa uji dengan persen penangkapan radikal
yang dimilikinya. Semakin kecil nilai IC
50
, maka semakin aktif suatu ekstrak tanaman sebagai senyawa antioksidan.
Rutin digunakan sebagai senyawa pembanding dalam uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik kulit buah jeruk purut ini karena
rutin merupakan senyawa antioksidan alami golongan flavonoid yang telah diketahui memiliki potensi penangkapan radikal yang poten.
Gambar 9. Struktur rutin dos Santos et al., 2008
Tabel VII. Hasil perhitungan IC
50
rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit buah jeruk purut
Bahan Uji IC
50
µg2mL Rata-rata
µg2mL SD
CV Replikasi
1 Replikasi
2 Replikasi
3 rutin
23,08 24,31
24,93 24,11
0,94 0,882
Fraksi etil asetat
964,60 957,70
965,70 962,67
4,34 0,005
Dari analisis regresi linier diperoleh nilai IC
50
rata-rata rutin sebesar 24,108
gmL. Hal ini berarti untuk menangkap radikal bebas sebesar 50 diperlukan konsentrasi rutin sebesar 24,108
gmL. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik kulit buah jeruk
purut dengan metode DPPH disajikan pada tabel berikut.
Tabel VIII. Penggolongan Tingkat Kekuatan Antioksidan Rutin dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol kulit buah jeruk purut Aryanto, 2006
Intensitas Nilai IC
50
Rutin Fraksi etilasetat
ekstrak etanol Sangat kuat
50 µgmL √
- Kuat
50-100 µgmL -
- Sedang
101-150 µgmL -
- Lemah
150 µgmL -
√
Hasil kekuatan antioksidan tergolong sangat lemah dibanding baku rutin, karena lebih dari 150 µgmL.
H. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total
