Bahan-Bahan yang Digunakan Sukarelawan Pembuatan Ekstrak Daun Pandan Wangi Uji Iritasi terhadap Kulit Relawan

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian ini adalah eksperimental. Penelitian meliputi pengambilan sampel daun pandan wangi, pembuatan ekstrak daun pandan wangi, pembuatan sediaan krim pelembab, evaluasi terhadap mutu fisik sediaan seperti uji homogenitas, uji stabilitas sediaan, uji pH, uji penentuan tipe emulsi, uji iritasi terhadap kulit sukarelawan, uji kemampuan sediaan untuk mengurangi penguapan air, dan uji hedonik kesukaan. 3.1 Alat yang Digunakan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah:alat perkolasi, benang, mikroskop, tutup pot plastik, kain kasa, batang pengaduk, spatel, pot plastik, selotip transparan, penangas air, freeze dryer VirTis “benchtop K”, pH meter Hanna Instrument, neraca analitik Boeco Germany, dan alat-alat gelas laboratorium.

3.2 Bahan-Bahan yang Digunakan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: daun pandan wangi, etanol 80, asam stearat, setil alkohol, trietanolamin TEA, gliserin, nipagin, natrium metabisulfit, air suling, metil biru, larutan dapar pH asam 4,01, dan larutan dapar pH netral 7,01.

3.3 Sukarelawan

Sukarelawan yang dijadikan panelis pada uji iritasi dan penentuan kemampuan sediaan untuk mengurangi penguapan air dari kulit berjumlah 12 orang dengan kriteria sebagai berikut Ditjen POM, 1985: 21 1. Wanita berbadan sehat 2. Usia diantara 20-30 tahun 3. Tidak ada riwayat penyakit yang berhubungan dengan alergi 4. Bersedia menjadi sukarelawan Sukarelawan terdiri mahasiswi fakultas farmasi USU untuk lebih memudahkan jalannya penelitian dalam penentuan kemampuan sediaan untuk mengurangi penguapan air dari kulit

3.4 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel

3.4.1 Pengumpulan bahan

Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Bahan tumbuhan yang digunakan adalah daun pandan wangi yang diambil dari daerah Simalingkar B, Provinsi Sumatera Utara.

3.4.2 Identifikasi tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI. 3.4.3 Pembuatan simplisia daun pandan wangi Daun pandan wangi dikumpulkan, kemudian dibersihkan dari kotoran- kotoran, dicuci dengan air sampai bersih, ditiriskan, kemudian dirajang, setelah itu dikeringkan di lemari pengering sampai kering yaitu jika simplisia tersebut diremas akan hancur. Identifikasi simplisia dilakukan secara organoleptik bentuk, warna, rasa, dan bauaroma. Bahan yang telah kering itu kemudian dihaluskan dengan blender dan ditimbang sebagai berat kering simplisia. Selanjutnya, dimasukkan dalam wadah plastik tertutup. 22

3.5 Pembuatan Pereaksi

3.5.1 Besi III klorida

Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling sampai 100 ml.

3.5.2 Larutan HCl 2 N

Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling sampai 100 ml Depkes RI, 1995.

3.5.3 Timbal II asetat 0,4 M

Timbal II asetat sebanyak 15,17 g dilarutkan dalam air suling bebas CO 2 hingga 100 ml.

3.5.4 Pereaksi mayer

Sebanyak 1,4 g raksa II klorida, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah ditimbang sebanyak 5 g kalium iodide lalu dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml.

3.5.5 Pereaksi molish

Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam sitrat 0,5 N hingga 100 ml.

3.5.6 Pereaksi dragendorff

Sebanyak 0,8 g bismut nitrat dilarutkan dalam asam nitrat pekat 20 ml kemudian dicampurkan dengan larutan kalium iodide sebanyak 27,2 g dalam 50 ml air suling. Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih diambil dan diencerkan dengan air suling secukupnya hingga 100 ml.

3.5.7 Larutan kloralhidrat 70

Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Ditjen POM, 1979. 23

3.5.8 Larutan asam sulfat 2 N

Sebanyak 5,5 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air air suling hingga diperoleh 100 ml.

3.5.9 Pereaksi bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling secukupnya, ditambahkan 2 g iodida sedikit demi sedikit cukupkan dengan air suling.

3.5.10 Pereaksi liebermann-burchard

Dicampur secara perlahan 5 ml asam asetat anhidrit dengan 5 ml asam sulfat pekat tambahkan etanol hingga 50 ml.

3.6 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, kadar abu total, dan kadar abu tidak larut asam Depkes RI, 1995; WHO, 1992.

3.6.1 Pemeriksaan makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati morfologi bahan segar dan simplisia daun pandan wangi. 3.6.2 Pemeriksaan mikroskopik Pemeriksaan mikroskopik terhadap serbuk simplisia daun pandan wangi dilakukan dengan cara menaburkan serbuk simplisia di atas kaca objek yang telah diteteskan dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup kemudian dilihat di bawah mikroskop. Dilakukan juga pemeriksaan mikroskopikmenggunakan air suling sebagai pengganti kloralhidrat.

3.6.3 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. 24 Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung penyambung, dan tabung penerima 10 ml. a. Penjenuhan toluena Sebanyak 200 ml toluena dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. b. Penetapan kadar air simplisia Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.

3.6.4 Penetapan kadar sari larut air

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan 25 selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.

3.6.5 Penetapan kadar sari larut etanol

Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring, 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.6.6 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus platina atau krus silikat yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600°C selama 3 jam. Kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.

3.6.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam

Abu yang telah diperoleh dalam penetapan abu didinginkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring dengan kertas masir atau kertas saring bebas abu, cuci 26 dengan air panas, dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bobot yang dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.

3.7 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia meliputi pemeriksaan alkaloida, flavonoida, saponin, glikosida, tanin dan steroidatriterpenoida.

3.7.1 Pemeriksaan alkaloida

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, kemudian ditambah 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, dinginkan dan disaring. Filtrat digunakan untuk percobaan berikut : a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning. b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah pereaksi bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes pereaksi dragendorff, akan terbentuk warna merah atau jingga. Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit 2 dari ketiga percobaan diatas Ditjen POM, 1979.

3.7.2 Pemeriksaan flavonoid

Larutan Percobaan: Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml metanol lalu direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring berlipat, filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambah 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, didiamkan. Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40 o C. Sisa dilarutkan dalam 5 ml etil asetat, disaring. 27 Cara Percobaan: a. Larutan percobaan sebanyak 1 ml diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan dalam 1-2 ml etanol 96, ditambahkan 0,5 g serbuk seng dan 2 ml asam klorida 2 N, didiamkan selama satu menit. Ditambahkan 10 ml asam klorida pekat, jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoida glikosida- 3-flavonol. b. Larutan percobaan sebanyak 1 ml diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan dalam 1 ml etanol 96, ditambahkan 0,1 g magnesium dan 10 ml asam klorida pekat, terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoida Ditjen POM, 1979.

3.7.3 Pemeriksaan glikosida

Serbuk simplisia daun pandan wangi ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50°C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan dimasukan dalam tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara perlahan- lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan ikatan gula Ditjen POM, 1979. 28

3.7.4 Pemeriksaan saponin

Serbuk simplisia daun pandan wangi ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukan adanya saponin Ditjen POM, 1979.

3.7.5 Pemeriksaan tanin

Serbuk simplisia daun pandan wangi ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 3 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes peraksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukan adanya tannin Farnsworth, 1966.

3.7.6 Pemeriksaan steroida triterpenoida

Serbuk simplisia daun pandan wangi ditimbang 1 g,dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard. Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukan adanya steroid, sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoida Harborne, 1987.

3.8 Pembuatan Ekstrak Daun Pandan Wangi

Pembuatan ekstrak daun pandan wangi dilakukan secara perkolasi menggunakan etanol 80. Cara kerja: sebanyak 300 g serbuk simplisia dibasahi dengan etanol 80 dan dibiarkan selama 3 jam. Kemudian dimasukkan ke dalam alat perkolator, lalu dituang cairan penyari etanol sampai semua simplisia terendam dan terdapat selapis cairan penyari di atasnya, mulut tabung perkolator ditutup dan dibiarkan 29 selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan perkolat diatur 1 mlmenit, perkolat ditampung. Perkolasi dihentikan bila 500 mg perkolat terakhir diuapkan tidak meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan alat rotary evaporator pada suhu ± 40 o C, kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer -40 o C Ditjen POM, 1979.

3.9 Formulasi Sediaan Krim

3.9.1 Formula standar handcream Young, 1972

Asam stearat 12 g Setil alkohol 0,5 g Sorbitol sirup 5 g Propilen glikol 3 g Trietanolamin 1 g Gliserin 1-5 tetes Nipagin 1 sendok spatula Parfum 3 tetes Air suling ad 78,2 ml

3.9.2 Formula yang dimodifikasi

Asam stearat 12 g Setil alkohol 0,5 g Trietanolamin 1 g Nipagin 0,1 g Natrium metabisulfit 0,1 g Ekstrak daun pandan wangi X Air suling ad 100 ml

3.9.3 Pembuatan Sediaan Krim

Konsentrasi ekstrak daun pandan wangi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 0,5 , 1, 1,5, 2, 2,5, 3, dan gliserin 2 . 30 Adapun formula yang digunakan, dapat dilihat pada Tabel 3.1. Cara pembuatan : Asam stearat dan setil alkohol dimasukkan ke dalam cawan penguap dan dilebur di atas penangas air massa 1. Nipagin dilarutkan dalam air panas, lalu ditambahkan natrium metabisulfit dan trietanolamin diaduk sampai larut massa II. Lalu ditambahkan massa II ke dalam massa I di dalam lumpang panas sambil digerus secara terus menerus hingga terbentuk dasar krim. Ekstrak daun pandan wangi digerus di dalam lumpang, lalu ditambahkan sedikit demi sedikit dasar krim dan gerus homogen. Tabel 3.1 Formula sediaan krim yang dibuat A B C D E F G H Eksrak daun pandan wangi gram - 0,5 1 1,5 2 2,5 3 - Gliserin gram - - - - - - - 2 Dasar krim gram ad 100 ad 100 ad 100 ad 100 ad 100 ad 100 ad 100 ad 100 Keterangan: A : Krim blanko B : Krim ekstrak daun pandan wangi 0,5 C : Krim ekstrak daun pandan wangi 1,0 D : Krim ekstrak daun pandan wangi 1,5 E : Krim ekstrak daun pandan wangi 2,0 F : Krim ekstrak daun pandan wangi 2,5 G : Krim ekstrak daun pandan wangi 3,0 H : Krim gliserin 2,0 3.10 Evaluasi Mutu Fisik Sediaan 3.10.1 Pengujian homogenitas Sejumlah tertentu sediaan jika dioleskan pada sekeping kaca atau bahan transparan lain yang cocok sediaan harus menunjukkan susunan yang homogen Formula Komposisi 31 dan tidak terlihat adanya butiran kasar Ditjen POM, 1979.

3.10.2 Pengamatan stabilitas sediaan

Masing-masing formula sediaan dimasukkan ke dalam pot plastik . Ditutup bagian atasnya dengan plastik. Selanjutnya dilakukan pengamatan berupa pecah tidaknya emulsi, perubahan warna, dan perubahan bau pada saat sediaan selesai dibuat serta dalam penyimpanan selama 1,4,8, dan 12 minggu Ansel, 2005.

3.10.3 Pengukuran pH sediaan

Pengukuran pH sediaan dilakukan dengan menggunakan pH meter. Alat terlebih dahulu dikalibrasi menggunakan larutan dapar standar netral pH 7,01 dan larutan dapar pH asam pH 4,01 hingga alat menunjukkan harga pH tersebut. Kemudian elektroda dicuci dengan air suling, lalu dikeringkan dengan tisu. Sampel dibuat dalam konsentrasi 1 yaitu ditimbang 1 gram sediaan dan dilarutkan dalam 100 ml air suling. Kemudian elektroda dicelupkan dalam larutan tersebut. Dibiarkan alat menunjukkan harga pH sampai konstan. Angka yang ditunjukkan pH meter merupakan pH sediaan Rawlins, 2003.

3.10.4 Penentuan tipe emulsi sediaan

Sejumlah tertentu sediaan diletakkan di atas objek gelas, ditambahkan 1 tetes metil biru, diaduk dengan batang pengaduk. Tutup dengan kaca penutup dan diamati di bawah mikroskop. Bila metil biru tersebar merata berarti sediaan tersebut tipe emulsi ma Ditjen POM, 1985.

3.11 Uji Iritasi terhadap Kulit Relawan

Percobaan ini dilakukan pada 12 orang sukarelawan. Sediaan dioleskan dibelakang telinga membentuk lingkaran dengan diameter 3 cm, lalu dibiarkan selama 24 jam dengan diamati setiap 4 jam sekali apakah terjadi iritasi kulit atau 32 tidak Ditjen POM, 1985. Penilaian berdasarkan kategori eritema: tidak eritema 0, sangat sedikit eritema 1, sedikit eritema 2, eritema sedang 3, eritema sangat parah 4 dan kategori edema: tidak edema 0, sangat sedikit edema 1, sedikit edema 2, edema sedang 3, edema sangat parah 4 Barel, et al., 2009.