Identifikasi Komponen Asap Cair Guillen Ibargoitia 1999 Preparasi Sampel Uji Toksisitas Akut Penentuan LD

18

3.4. Penelitian Tahap I

Penelitian tahap I bertujuan untuk mengkaji keamanan pangan asap cair tempurung kelapa sebagai bahan pengawet alternatif yang aman. Pertama adalah mengidentifikasi komponen asap cair tempurung kelapa dengan Gas Chromatography–Mass Spectroscopy GC-MS Shimadzu QP2010. Jenis kolom yang digunakan adalah RTx-1 MS dengan panjang 30 m dan diameter dalam 0.32 mm. Komponen diidentifikasi berdasarkan waktu retensi dan mass spectra dibandingkan dengan pustaka Wiley 7; Nist 27; Nist 147. Kedua adalah uji toksisitas akut asap cair tempurung kelapa dengan menentukan nilai LD 50 . Uji toksisitas akut mengacu pada OECD 402 2001. Metode ini menggunakan sedikit hewan percobaan, yaitu 3 hewan setiap perlakuan. Nilai LD 50 ditentukan dari dosis suatu senyawa atau bahan yang menyebabkan kematian 50 dari hewan percobaan.

3.4.1. Identifikasi Komponen Asap Cair Guillen Ibargoitia 1999 Preparasi Sampel

Asap cair sebanyak 30 ml dimasukkan dalam labu pisah, kemudian ditambahkan 10 ml dichloromethane lalu dikocok sebentar. Sampel didiamkan selama 1 jam lalu diambil fraksi bagian bawah ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan lagi 10 ml dichloromethane lalu kocok dan didiamkan selama 1 jam. Selanjutnya diambil fraksi bagian bawah dan tambahkan dengan yang pertama, dan disaring dengan kertas Whatman 42 dengan ditambahkan Na 2 SO 4 . Hasil saringan siap untuk diinjek. Kondisi Pengoperasian GCMS GCMS-QP2010 dioptimasikan pada suhu oven 100 C yang dipertahankan selama 4 menit, suhu kemudian ditingkatkan menjadi 200 C dengan kenaikan 20 Cmenit dan dipertahankan selama 2 menit, suhu ditingkatkan lagi menjadi 300 C dengan kenaikan suhu 20 Cmenit dan dipertahankan selama 16 menit. Suhu pada sumber ion disetel pada 230 C sedangkan suhu injector diset pada 260 C. Analisis ini menggunakan gas helium yang memiliki kemurnian 99.99 19 dengan tekanan gas 62.7 kPa. Sampel diinjeksikan dalam kromatografi gas sebanyak 1 µL, dianalisis dari berat molekul 50.00 sampai 500.00 dalam waktu 3 sampai 32 menit.

3.4.2. Uji Toksisitas Akut Penentuan LD

50 Hewan Uji Hewan uji yang digunakan adalah mencit jantan dengan umur rata-rata 5-6 minggu dengan berat lebih kurang 20-25 gram, diperoleh dari Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Variasi berat badan hewan uji mencit tidak boleh lebih dari 20 dari berat badan rata-rata. Prosedur Pengujian Hewan uji mencit yang sehat diaklimatisasi atau diadaptasikan pada kondisi laboratorium dalam suatu kandang minimal selama 7 hari dan diberi makan dengan takaran pakan yang diberikan adalah 5 gramekorhari serta diberi minum 1-2 mlgram makanan. Selama masa aklimatisasi semua mencit ditimbang setiap hari. Satu kandang berukuran kurang lebih 30x20 cm 2 digunakan untuk menyimpan 3 ekor mencit. Setiap dua hari kandang dibersihkan dan dilakukan disinfektasi sekali dalam seminggu. Setelah itu, mencit dibagi dalam bentuk kelompok berdasarkan dosis dengan rincian seperti pada Tabel 4. Tabel 4 Rincian Seri Dosis untuk Uji Toksisitas Akut Kelompok Dosis perlakuan mgkg Kontrol 50 500 5.000 15.000 1 3 - - - - 2 - 3 - - - 3 - - 3 - - 4 - - - 3 - 5 - - - - 3 Tabel 4 menunjukkan bahwa dalam setiap perlakuan, yaitu dosis asap cair 0, 50, 500, 5.000, dan 15.000 mgkg BB, digunakan 3 ekor mencit. Pengelompokan dilakukan secara acak berdasarkan berat badan mencit, kemudian diberi tandanomor pengenalnya untuk setiap kelompok tingkat dosis. Sebelum 20 diberi perlakuan mencit dipuasakan dahulu selama minimal 4 jam. Masing- masing dosis diberikan 1x tunggal, yaitu pada hari pertama kepada 3 ekor mencit jantan dengan pencekokan masing-masing sebanyak 1 ml. Pencekokan dilakukan secara oral menggunakan sonde. Mencit kontrol hanya diberi air aquades tanpa asap cair sebanyak 1 ml. Pengamatan dilakukan selama interval waktu 24 jam selama 14 hari. Persentase kematian untuk tiap dosis apabila ada dicatat dalam tabel. Mencit yang masih hidup berat badannya terus ditimbang selama pengamatan. Analisis data dilakukan berdasarkan laju peningkatan berat badan rata-rata mencit dan jumlah kematian mencit untuk masing-masing dosis. 3.5. Penelitian Tahap II Penelitian tahap II dilakukan untuk menguji aktivitas antibakteri asap cair tempurung kelapa. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan mencari nilai MIC Minimum Inhibitory Concentration asap cair tempurung kelapa terhadap 2 bakteri uji, yaitu Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa. Nilai MIC dapat diartikan sebagai konsentrasi terkecil dari suatu bahan yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba sebesar 90 selama inkubasi 24 jam Cosentino et al. 1999 di dalam Sara 2004.

3.5.1. Persiapan Kultur Mikroba