18
3.4. Penelitian Tahap I
Penelitian tahap I bertujuan untuk mengkaji keamanan pangan asap cair tempurung kelapa sebagai bahan pengawet alternatif yang aman. Pertama adalah
mengidentifikasi komponen asap cair tempurung kelapa dengan Gas Chromatography–Mass Spectroscopy GC-MS Shimadzu QP2010. Jenis kolom
yang digunakan adalah RTx-1 MS dengan panjang 30 m dan diameter dalam 0.32 mm. Komponen diidentifikasi berdasarkan waktu retensi dan mass spectra
dibandingkan dengan pustaka Wiley 7; Nist 27; Nist 147. Kedua adalah uji toksisitas akut asap cair tempurung kelapa dengan menentukan nilai LD
50
. Uji toksisitas akut mengacu pada OECD 402 2001. Metode ini menggunakan sedikit
hewan percobaan, yaitu 3 hewan setiap perlakuan. Nilai LD
50
ditentukan dari dosis suatu senyawa atau bahan yang menyebabkan kematian 50 dari hewan
percobaan.
3.4.1. Identifikasi Komponen Asap Cair Guillen Ibargoitia 1999 Preparasi Sampel
Asap cair sebanyak 30 ml dimasukkan dalam labu pisah, kemudian ditambahkan 10 ml dichloromethane lalu dikocok sebentar. Sampel didiamkan
selama 1 jam lalu diambil fraksi bagian bawah ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan lagi 10 ml dichloromethane lalu kocok dan didiamkan selama 1
jam. Selanjutnya diambil fraksi bagian bawah dan tambahkan dengan yang pertama, dan disaring dengan kertas Whatman 42 dengan ditambahkan Na
2
SO
4
. Hasil saringan siap untuk diinjek.
Kondisi Pengoperasian GCMS
GCMS-QP2010 dioptimasikan pada suhu oven 100 C yang dipertahankan
selama 4 menit, suhu kemudian ditingkatkan menjadi 200 C dengan kenaikan
20 Cmenit dan dipertahankan selama 2 menit, suhu ditingkatkan lagi menjadi
300 C dengan kenaikan suhu 20
Cmenit dan dipertahankan selama 16 menit. Suhu pada sumber ion disetel pada 230
C sedangkan suhu injector diset pada 260
C. Analisis ini menggunakan gas helium yang memiliki kemurnian 99.99
19 dengan tekanan gas 62.7 kPa. Sampel diinjeksikan dalam kromatografi gas
sebanyak 1 µL, dianalisis dari berat molekul 50.00 sampai 500.00 dalam waktu 3 sampai 32 menit.
3.4.2. Uji Toksisitas Akut Penentuan LD
50
Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan adalah mencit jantan dengan umur rata-rata 5-6 minggu dengan berat lebih kurang 20-25 gram, diperoleh dari Fakultas
Kedokteran Hewan IPB. Variasi berat badan hewan uji mencit tidak boleh lebih dari 20 dari berat badan rata-rata.
Prosedur Pengujian Hewan uji mencit yang sehat diaklimatisasi atau diadaptasikan pada
kondisi laboratorium dalam suatu kandang minimal selama 7 hari dan diberi makan dengan takaran pakan yang diberikan adalah 5 gramekorhari serta diberi
minum 1-2 mlgram makanan. Selama masa aklimatisasi semua mencit ditimbang setiap hari. Satu kandang berukuran kurang lebih 30x20 cm
2
digunakan untuk menyimpan 3 ekor mencit. Setiap dua hari kandang dibersihkan dan dilakukan
disinfektasi sekali dalam seminggu. Setelah itu, mencit dibagi dalam bentuk kelompok berdasarkan dosis
dengan rincian seperti pada Tabel 4. Tabel 4 Rincian Seri Dosis untuk Uji Toksisitas Akut
Kelompok Dosis perlakuan mgkg
Kontrol 50
500 5.000
15.000
1 3
- -
- -
2 -
3 -
- -
3 -
- 3
- -
4 -
- -
3 -
5 -
- -
- 3
Tabel 4 menunjukkan bahwa dalam setiap perlakuan, yaitu dosis asap cair 0, 50, 500, 5.000, dan 15.000 mgkg BB, digunakan 3 ekor mencit.
Pengelompokan dilakukan secara acak berdasarkan berat badan mencit, kemudian diberi tandanomor pengenalnya untuk setiap kelompok tingkat dosis. Sebelum
20 diberi perlakuan mencit dipuasakan dahulu selama minimal 4 jam. Masing-
masing dosis diberikan 1x tunggal, yaitu pada hari pertama kepada 3 ekor mencit jantan dengan pencekokan masing-masing sebanyak 1 ml. Pencekokan
dilakukan secara oral menggunakan sonde. Mencit kontrol hanya diberi air aquades tanpa asap cair sebanyak 1 ml. Pengamatan dilakukan selama interval
waktu 24 jam selama 14 hari. Persentase kematian untuk tiap dosis apabila ada dicatat dalam tabel. Mencit yang masih hidup berat badannya terus ditimbang
selama pengamatan. Analisis data dilakukan berdasarkan laju peningkatan berat badan rata-rata mencit dan jumlah kematian mencit untuk masing-masing dosis.
3.5. Penelitian Tahap II
Penelitian tahap II dilakukan untuk menguji aktivitas antibakteri asap cair tempurung kelapa. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan mencari nilai MIC
Minimum Inhibitory Concentration asap cair tempurung kelapa terhadap 2 bakteri uji, yaitu Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa. Nilai
MIC dapat diartikan sebagai konsentrasi terkecil dari suatu bahan yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba sebesar 90 selama inkubasi 24 jam
Cosentino et al. 1999 di dalam Sara 2004.
3.5.1. Persiapan Kultur Mikroba