Alat Bahan-bahan Sterilisasi Alat Pembuatan Media Agar Miring Pembuatan Stok Kultur

18

BAB III METODE PENELITIAN

Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan tahapan penelitian yaitu pengambilan bahan tumbuhan, identifikasi, pembuatan simplisia, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak dan fraksi-fraksi. Pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar menggunakan kertas cakram Uji Kirby-Bauer. Parameter yang diamati yaitu besarnya diameter daya hambat pertumbuhan bakteri. Penelitian dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

3.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, autoklaf Fisons, blender Panasonic, desikator, hot plate Fisons, inkubator Fiber Scientific, jarum ose, jangka sorong, kamera digital Samsung, krus porcelin, lemari pendingin Glacio, mikroskop Olympus, mikro pipet Eppendorf, neraca listrik Mettler Tolledo, neraca kasar, oven Memmert, penangas air, pinset, rotary evaporator Haake D, seperangkat alat penetapan kadar air, statif dan klem, spatula, spekrofotometer visibel Dynamica dan tanur Nabertherm.

3.2 Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah simplisia daun bunga jeumpa, etanol 80, dan air suling. Bahan kimia yang digunakan berkualitas pro analisis, kecuali dinyatakan lain, yaitu: alfa naftol, amil alkohol 19 asam klorida pekat, asam asetat anhidrida, asam nitrat, asam sulfat pekat, besi III klorida, benzena, bismuth III nitrat, etanol, eter, etilasetat, isopropanol, iodium, dimetilsulfoksida DMSO, kalium klorida, kloral hidrat, n-heksana, natrium sulfat anhidrida, raksa II klorida, serbuk magnesium, timbal II asetat dan toluena. Bakteri yang digunakan yaitu bakteri Escherichia coli standart ATCC 25922, bakteri Staphylococcus aureus standart ATCC 29213. Media yang digunakan adalah nutrient agar NA, nutrient broth NB.

3.3 Persiapan Bahan

3.3.1 Pengambilan bahan tanaman

Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tanaman yang sama dari daerah lain. Bahan tanaman yang digunakan adalah daun bunga jeumpa yang masih hijau dan segar dari jenis bunga jeumpa kuning, yang diperoleh di Desa Meunasah Mee, Kecamatan Jangka Buya, Kabupaten Pidie Jaya, Provinsi Aceh.

3.3.2 Identifikasi tanaman

Identifikasi tanaman dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi-LIPI, Bogor.

3.3.3 Pembuatan simplisia

Pembuatan simplisia dilakukan dengan cara daun bunga jeumpa yang telah dikumpulkan, dibersihkan dari pengotor, lalu dicuci dengan air sampai bersih dan ditiriskan. Selanjutnya dikeringkan dengan cara diangin-anginkan terlebih dahulu, lalu dikeringkan di dalam lemari pengering sampai simplisia rapuh ketika diremas. Selanjutnya diblender sampai menjadi serbuk dan 20 disimpan dalam wadah dan ditutup rapat. Bagan penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 44.

3.4 Pembuatan Pereaksi

Pembuatan pereaksi Bauchardat, Mayer, molish, kloral hidrat, pereaksi timbal II asetat 0,4 M, natrium hidroksida 2 N, asam sulfat 2 N dan Liebermann-Burchard berdasarkan Depkes RI, 1995, asam klorida 2N Depkes RI, 1979, Dragendorff Harborne, 1987.

3.4.1 Pereaksi Bouchardat

Larutkan 2 g iodium P dan 4 g kalium iodida P dalam air suling secukupnya hingga 100 ml.

3.4.2 Pereaksi Dragendorff

Dibuat dua larutan persediaan: 1 0,6 g bismut sub nitrat dalam 2 ml asam klorida pekat dan 10 ml air suling: 2 6 g kalium iodida dalam 10 ml air. Kedua larutan dicampur dengan 7 ml asam klorida pekat dan 15 ml air suling.

3.4.3 Pereaksi Mayer

Sebanyak 1,36 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain ditimbang 5 g kalium kalium iodida, dilarutkan dalam 10 ml air suling kemudian kedua larutan dicampur dan ditambahkan air suling hingga 100 ml.

3.4.4 Pereaksi besi III klorida 1

Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling sampai 100 ml.

3.4.5 Pereaksi molish

Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 ml. 21

3.4.6 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M

Larutan timbal II asetat sebanyak 15,17 g dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml. 3.4.7 Pereaksi asam klorida 2 N Larutan asam klorida P sebanyak 17 ml diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.

3.4.8 Pereaksi natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8,001 g pellet natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml.

3.4.9 Pereaksi asam sulfat 2 N

Larutan asam sulfat P sebanyak 9,8 ml ditambahkan air suling hingga 100 ml.

3.4.10 Pereaksi Liebermann-Burchard

Campurkan 5 g bagian volume asam sulfat P dengan 50 bagian volume etanol 95 P. Tambahkan hati-hati 5 bagian volume asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut, dinginkan.

3.4.11 Larutan kloral hidrat

Larutkan 50 g kloral hidrat P dalam 20 ml air suling.

3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

3.5.1 Pemeriksaan makroskopik

Pemeriksaan makroskopik meliputi bentuk, bau, rasa dan warna dari simplisia daun bunga jeumpa. 22

3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun bunga jeumpa. Caranya, yaitu pada kaca objek ditetesi dengan kloral hidrat kemudian ditambahkan sedikit serbuk simplisia dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian dilihat di bawah mikroskop. Hasilnya dapat lihat pada Lampiran 3, halaman 43.

3.5.3 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung penyambung dan tabung penerima. Cara penetapannya, yaitu: Pada labu bulat dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling, didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air di dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu yang berisi toluena jenuh tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang saksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mulai mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes per detik hingga sebagian air tersuling, kemudian kecepatan dinaikkan hingga 4 tetes per detik, kemudian setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen Depkes, 1995.

3.5.4 Penetapan kadar sari larut air

Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml 23 air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.5.5 Penetapan kadar sari larut etanol

Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selam 24 jam dalam 100 ml etanol 95 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.5.6 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porcelin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600 o C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995. 3.5.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam 24 asam dikumpulkan, disaring dengan kertas saring, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bobot yang dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.6 Skrining Fitokimia

Pemeriksaan alkaloid, glikosida, tanin, saponin, antrakinon berdasarkan Depkes RI, 1995, tanin dan flavonoid Fansworth, 1966, steroidtriterpenoid Harborne, 1987.

3.6.1 Pemeriksaan alkaloid

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: 1. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Mayer akan terbentuk endapan menggumpal bewarna putih atau kuning. 2. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Bauchardat akan terbentuk endapan bewarna coklat hitam. 3. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Dragendorff akan terbentuk endapan bewarna merah atau jingga. Alkaloid dinyatakan positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau tiga dari percobaan di atas.

3.6.2 Pemeriksaan flavonoid

Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 25 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.

3.6.3 Pemeriksaan glikosida

Sebanyak 3 g simplisia disari dengan 30 ml campuran 7 bagian etanol 95 P dan 3 bagian air dalam alat pendingin alir balik selama 30 menit, dinginkan, disaring. Pada 20 ml filtrat tambahkan 25 ml air dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit lalu disaring. Sari 3 kali dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2 bagian isopropanol P, kemudian akan diperoleh dua lapisan. Kumpulkan masing-masing sari sari air dan sari pelarut organik. Sari pelarut organik ditambahkan Na 2 SO 4 anhidrat, kemudian disaring, lalu filtrat diuapkan pada suhu tidak lebih 50 o C. Sisa penguapan dilarutkan dalam 2 ml metanol. Diambil lapisan air dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi molish, ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat terbentuk cincin ungu pada batas cairan, reaksi ini menunjukkan adanya gula.

3.6.4 Pemeriksaan tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1, terbentuk warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.

3.6.5 Pemeriksaan saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 26 selama 10 detik. Jika terbentuk buih setinggi 1-10 cm yang mantap tidak kurang selama 10 menit dan pada penambahan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, buih tidak hilang, menunjukkan adanya saponin.

3.6.6 Pemeriksaan steroidtriterpenoid

Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksana selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa dalam cawan penguap ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Liebermann-Burchard. Diteteskan pada saat akan mereaksikan sampel uji. Timbul warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi hijau biru menunjukkan adanya steroid-triterpenoid.

3.6.7 Pemeriksaan antrakinon

Campur 0,2 g serbuk simplisia dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, didinginkan. Tambahkan 10 ml benzena P, dikocok dan didiamkan. Pisahkan lapisan benzena, disaring, filtrat bewarna kuning, menunjukkan adanya antrakinon. Kocok lapisan benzena dengan 1 ml sampai 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon.

3.7 Pembuatan Ekstrak Daun Bunga Jeumpa

3.7.1 Pembuatan ekstrak etanol EEBJ

Sebanyak 300 gram serbuk simplisia dimaserasi dengan 75 bagian etanol 80 dalam wadah dan ditutup rapat. Selanjutnya, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya matahari sambil diaduk, kemudian disaring dan ampas dimaserasi kembali dengan etanol 80 secukupnya hingga diperoleh 100 bagian 27 Depkes RI, 1979. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada temperatur ±40 o C sampai diperoleh ekstrak kental.

3.7.2 Pembuatan fraksi n-heksana FHBJ dan fraksi etilasetat FEABJ

Pembuatan fraksi-fraksi dilakukan secara ekstraksi cair-cair ECC atau ekstraksi bertingkat dengan menggunakan pelarut n-heksana dan etilasetat. Sebanyak 5 g ekstrak etanol ditambahkan etanol dan 10 ml air suling, lalu dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian ditambahkan 20 ml n-heksana, dikocok, didiamkan sampai terdapat 2 lapisan, n-heksana lapisan atas diambil dengan cara dekantasi dan fraksinasi dilakukan sampai warna lapisan n-heksana jernih diperoleh fraksi n-heksana FHBJ. Pada residu ditambahkan 20 ml etilasetat pada lapisan air, dikocok, didiamkan sampai terdapat 2 lapisan yang terpisah, lapisan etilasetat lapisan atas diambil dengan cara dekantasi, dan fraksinasi kembali sampai warna lapisan etilasetat jernih diperoleh fraksi etilasetat FEABJ. Fraksi yang diperoleh diuapkan sampai menjadi ekstrak kental dan di hair dryer untuk membebaskan sisa pelarut. Masing-masing fraksi yang diperoleh dilakukan uji aktivitas antibakteri. Bagan ekstraksi dan fraksinasi dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 45.

3.8 Sterilisasi Alat

Alat-alat yang digunakan disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di dalam oven pada suhu 170 o C selama 1-2 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset dipijar dengan api bunsen Anonim, 2003. 28

3.9 Pembuatan Media

3.9.1 Media nutrient agar NA

Komposisi: Beef extract 3,0 g Peptone 5,0 g Agar 15,0 g Cara pembuatannya, yaitu: sebanyak 23 g nutrient agar NA dimasukkan ke dalam erlemenyer tambahkan air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut lalu disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Oxoid, 1982.

3.9.2 Media nutrient broth NB

Komposisi: Beef extract 3,0 g Peptone 5,0 g Cara pembuatannya, yaitu: sebanyak 5,2 g nutrient broth NB dimasukkan ke dalam erlemenyer tambahkan air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut kemudian disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Oxoid, 1982.

3.10 Pembuatan Media Agar Miring

Sebanyak 3 ml media nutrient agar NA yang sudah dicairkan dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring. Kemudian disimpan dalam lemari pendingin Ditjen POM, 1995.

3.11 Pembuatan Stok Kultur

Biakan bakteri Staphylococcus aureus dari strain utama diambil dengan 29 jarum ose lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar NA miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35±2 o C selama 18-24 jam Ditjen POM, 1995. Hal yang sama dilakukan pada biakan bakteri Escherichia coli.

3.12 Penyiapan Inokulum