BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental. Metodologi penelitian meliputi pengumpulan dan preparasi bahan, pembuatan
ekstrak etanol daun bangun-bangun, skrining fitokimia, isolasi minyak kedelai, pengujian daya antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococus aureus
dan Escherichia coli dengan metode difusi agar menggunakan punch hole, kemudian daya hambat Zona jernih diukur dengan menggunakan jangka sorong
serta pengujian daya antioksidan melalui pengukuran bilangan peroksida. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi USU,
Laboratorium Sintesa Bahan Obat Fakultas Farmasi USU, dan Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA USU.
3.1 Alat-alat yang digunakan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas, oven Gallenkamp, autoklaf Webeco, inkubator Fisher Scientific, lemari pendingin
Precicion, neraca kasar, neraca analitik Mettler AE 200, jarum ose, jangka sorong, pinset, bunsen, pencetak lubang punch hole, bola karet, vacuum rotary
evaporator Buchi.
3.2 Bahan-bahan yang digunakan
Bahan tumbuhan yang digunakan adalah daun bangun-bangun Coleus amboinicus L. berwarna hijau tua, serta kacang kedelai. Bahan kimia yang
digunakan berkualitas pro analisa produksi E-Merck: asam asetat anhidrat, asam asetat glasial, asam sulfat pekat, asam klorida, Besi III klorida, benzen, etanol,
eter, etil asetat, iodium, isopropanol, kalium iodida, klorofom, metanol, serbuk
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
magnesium, timbal II asetat, natrium tiosulfat, kalium bikromat, natrium karbonat, natrium hidroksida, asam klorida, kecuali Butil HidroksitoluenBHT
sigma, nutrient agar Difco, arang aktif, etanol hasil destilasi. Bakteri yang digunakan : Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli
ATCC 25922
3.3 Penyiapan bahan
Penyiapan bahan meliputi pengambilan bahan, determinasi tumbuhan dan pengolahan bahan tumbuhan.
3.3.1 Pengambilan bahan
Pengambilan bahan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tanaman yang sama dari daerah lain. Bahan diambil pada sore hari, dan
bagian yang diambil adalah daun bangun-bangun Coleus amboinicus L. yang masih segar, berwarna hijau tua. Daun bangun-bangun diambil dari Tembung,
Kampung Tapanuli, Kabupaten Deli Serdang. Kacang kedelai sebagai bahan pembuatan minyak kedelai yang digunakan sebagai media pengukuran bilangan
peroksida, diambil dari pajak Sore Padang Bulan.
3.3.2 Determinasi tumbuhan
Determinasi tumbuhan bangun-bangun dilakukan oleh pusat penelitian dan Pengembangan biologi-LIPI di Bogor dan determinasi kacang kedelai
dilakukan oleh Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Departemen Biologi, Fakultas MIPA, USU, Hasil selengkapnya dapat dilihat pada lampiran 1 halaman
45 dan lampiran 2 pada halaman 46.
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
3.3.3 Pengolahan bahan
Daun bangun-bangun yang telah dikumpulkan, dibersihkan disortasi basah, dicuci dengan air sampai bersih, kemudian ditiriskan lalu disebarkan,
setelah itu daun ditimbang. Kemudian daun dikeringkan di oven dengan suhu tidak melebihi 60°C sampai daun kering dan mudah rapuh, berat dari daun yang
kering ditimbang. Kemudian disimpan di tempat yang terlindung dari sinar matahari.
3.4 Pembuatan larutan pereaksi 3.4.1 Pereaksi Mayer
Larutan raksa II klorida P 2,266 bv sebanyak 60 ml dicampur dengan 10 ml larutan kalium iodida P 50 bv, kemudian ditambahkan air
secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
3.4.2 Pereaksi Dragendorff
Larutan bismut nitrat P 40 bv dalam asam nitrat P sebanyak 20 ml dicampur dengan 50 ml kalium iodida P 54,4 bv, didiamkan sampai memisah
sempurna. Lalu diambil lapisan jernihnya dan diencerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
3.4.3 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g Kalium iodida P dilarutkan dalam air secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium P kemudian ditambahkan air hingga 100 ml Depkes RI,
1980.
3.4.4 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol P, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga
diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1980.
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
3.4.5 Larutan besi III klorida 1 bv
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
3.4.6 Larutan timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat P dilarutkan dalam air bebas karbon dioksida hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
3.4.7 Larutan Natrium Hidroksida 2 N
Sebanyak 8,001 g natrium hidroksida, dilarutkan dalam air secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
3.4.8 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 20 ml asam asetat anhidrat dicampur dengan 1 ml asam sulfat pekat. Larutan ini harus dibuat baru Harborne, 1987.
3.4.9 Larutan asam klorida 2 N
Larutan asam klorida pekat sebanyak 17 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.4.10 Larutan asam sulfat 2 N
Larutan asam sulfat pekat sebanyak 9,8 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.4.11 Larutan Standar Natrium Tiosulfat 0,002 N
Ditimbang sebanyak 0,4963 g natrium tiosulfat dan 40 mg natrium karbonat, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida segar
secukupnya hingga 1000 ml Ditjen POM, 1979.
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
3.4.12 Pembakuan Larutan Standar Na
2
S
2
O
3
0,002 N
Ditimbang dengan seksama sebanyak 4,2 mg kalium bikromat yang sebelumnya telah dihaluskan dan dikeringkan pada suhu 120
C selama 4 jam, dan dilarutkan dalam 100 ml air suling dalam erlenmeyer. Digoyang hingga larut, dan
ditambah dengan cepat 60 mg kalium iodida, 40 mg natrium bikarbonat dan 5 ml asam klorida. Ditutup erlenmeyer dengan plastik dan karet, dikocok hingga larut,
kemudian dibiarkan ditempat yang gelap selama 10 menit. Dititrasi iodium yang dibebaskan dengan larutan natrium tiosulfat hingga berwarna hijau kekuningan,
kemudian ditambahkan 3 ml larutan kanji dan dilanjutkan titrasi hingga warna biru hilang. Kemudian normalitas larutan dihitung Ditjen POM, 1995.
N =
BE g
x
V 1
Keterangan: N = Normalitas Na
2
S
2
O
3
g = Berat K
2
Cr
2
O
7
yang ditimbang mg V = Volume Na
2
S
2
O
3
yang terpakai ml
3.4.13 Larutan HCl 25
Dipipet asam klorida 37 sebanyak 67,65 ml, kemudian diencerkan dengan air suling secukupnya sampai 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.4.14 Indikator Kanji
Ditimbang sebanyak 500 mg tepung kanji, kemudian disuspensikan dalam 5 ml air suling. Lalu ditambahkan air mendidih sedikit demi sedikit hingga 100
ml. Dididihkan beberapa menit hingga menjadi transparan, kemudian didinginkan Ditjen POM, 1979.
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
3.4.15 Larutan NaOH 12
Ditimbang NaOH sebanyak 12 g, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.5 Penetapan Kadar Air 3.5.1 Penjenuhan Toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2
jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,01 ml
3.5.2 Penetapan kadar air
Ke dalam labu yang berisi toluen jenuh diatas, dimasukkan 5 g serbuk daun bangun-bangun yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati
selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi
dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian
tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluene memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,01 ml. Selisih kedua
volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen. Ditjen POM, 1979. Hasil
selengkapnya dapat dilihat pada lampiran 3. Kadar air =
x 100
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
3.6 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi yaitu sebanyak 400 g serbuk daun bangun-bangun ditambahkan dengan etanol 96 sebanyak 3000 ml,
ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil berulang-ulang diaduk. Setelah 5 hari sari diserkai, ampas diperas. Cuci ampas dengan etanol
96 sebanyak 1000 ml kemudian ditutup dan terlindung dari cahaya selama 2 hari, kemudian dienap tuangkan dan disaring. Maserasi dihentikan jika maserat
tidak berwarna dan diuji secara kualitatif dengan Besi III klorida tidak memberikan hasil positif. Maserat yang dihasilkan dirotary evaporator pada suhu
tidak lebih dari 50 °C, hingga diperoleh ekstrak kental, ekstrak kental dipindahkan
ke dalam eksikator Ditjen POM, 1979.
3.7 Skrining fitokimia daun bangun-bangun Coleus amboinicus Lour.
3.7.1 Pemeriksaan Alkaloida
Serbuk daun bangun-bangun ditimbang sebanyak 0,5 g, kemudiaan ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas
penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring, filtrat dipakai untuk uji alkaloida. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalam masing-masing tabung reaksi
dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada tabung I : ditambahkan 2 tetes pereaksi mayer
Pada tabung II : ditambahkan 2 tetes pereaksi dragendorff Pada tabung III : ditambahkan 2 tetes pereaksi bouchardat
Alkaloid disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit 2 tabung reaksi dari percobaan diatas Depkes RI, 1995 .
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
3.7.2 Pemeriksaan Flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambah air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Kedalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g
serbuk magnesium Dan 1 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terdapat warna merah kekuningan atau jingga pada lapisan
amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.7.3 Pemeriksaan Glikosida
Sebanyak 3 g serbuk daun bangun-bangun ditimbang, lalu disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 95 dan 3 bagian air suling.
Kemudiaan direfluks selama 10 menit, didinginkan, lalu disaring. Diambil 20 ml filtrat , ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok,
didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran 2 bagian isopropanol dan 3 bagian kloroform, perlakuan ini diulangi sebanyak 3 kali. Sari
air dikumpulkan dan ditambahkan Na
2
SO
4
anhidrat, disaring, kemudiaan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50
C, sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: Sepersepuluh ml
larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes larutan perekasi Molish,
lalu ditambahkan dengan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula glikon Depkes RI,
1995.
3.7.4 Pemeriksaan Glikosida Antrakinon
Sebanyak 0,2 g serbuk daun bangun-bangun dicampur dengan 5 ml asam sulfat 2N, dipanaskan sebentar , setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen,
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
dikocok dan didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring, kemudian kocok dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah menunjukkan
adanya antrakinon Depkes RI, 1995.
3.5.5 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk daun bangun-bangun dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan, kemudian
dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Saponin positif jika terbentuk busa yang stabil tidak kurang dari 10 menit setinggi 1 sampai 10 cm dan dengan penambahan 1
tetes asam klorida 2 N buih tidak hilang Depkes RI, 1995.
3.7.6 Pemeriksaaan Tannin
Sebanyak 0,5 g serbuk daun bangun-bangun disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna.
Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya tannin
Depkes RI, 1989.
3.7.7 Pemeriksaan Triterpenoid Steroida
Sebanyak 1 g serbuk daun bangun-bangun dimaserasi dengan eter 20 ml selama 2 jam, disaring , lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa
ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Lieberman- burchard, diteteskan pada saat akan mereaksikan sampel uji. Apabila
terbentuk warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid
Harborne,1987.
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
3.8 Penentuan aktivitas antibakteri 3.8.1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini disterilkan lebih dahulu sebelum dipakai. Media pertumbuhan disterilkan di
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit dan alat-alat gelas disterilkan di oven pada suhu 160-170°C selama 1-2 jam. Jarum ose dibakar dengan nyala bunsen.
3.8.2 Pembuatan Media 3.8.2.1 Larutan NaCl 0,9
Komposisi : Natrium klorida 9 g Air suling hingga 1000 ml
Cara pembuatan: Ditimbang natrium klorida 9 g, lalu dilarutkan dalam air suling sedikit
demi sedikit dalam labu ukur 1000 ml sampai larut sempurna. Lalu ditambahkan air suling sampai garis tanda. Disterilkan di autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit Depkes RI, 1995.
3.8.2.2 Nutrient Agar
Komposisi : bacto-beef extract 3 g
Bacto-peptone 5 g
Bacto agar 15 g
Aqua ad 1000 ml
Cara pembuatan: Sebanyak 23 g serbuk nutrien agar disuspensikan dengan air suling
yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan sampai bahan
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
larut sempurna. Disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121 C selama 15
menit DIFCO, 1977
3.8.2.3 Pembuatan agar Miring
Ke dalam tabung reaksi steril dimasukkan 3 ml media nutrien agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan membeku pada posisi
miring kira-kira 45 C. Kemudian disimpan dalam lemari pendingin.
3.8.2.4 Suspensi Standar Mc. Farland Lennete, et al., 2005
Komposisi: Larutan asam sulfat 0,18 M
99,5 ml Larutan barium klorida 0,048 M
0,5 ml Cara pembuatan:
Dicampurkan kedua larutan di atas ke dalam tabung reaksi dan dikocok homogen. Apabila kekeruhan suspensi bakteri uji sama dengan kekeruhan
suspensi standar, berarti konsentrasi suspensi bakteri adalah 10
8
CFUml.
3.8.4 Pembuatan Stok Kultur Bakteri 3.8.4.1 Bakteri
Staphylococcus aureus
Diambil satu ose koloni bakteri Staphylococcus aureus dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanamkan pada media Nutrient Agar miring
dengan cara menggores, setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36 ± 1ºC selama 18-24 jam.
3.8.4.2 Bakteri Escherichia coli
Diambil satu ose koloni bakteri Escherichia coli dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanamkan pada media Nutrient Agar miring dengan cara
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
menggores, setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36 ± 1ºC selama 18- 24 jam.
3.8.5 Penyiapan Inokulum 3.8.5.1 Bakteri
Staphylococcus aureus
Dari stok kultur Staphylococcus aureus yang telah tumbuh diambil dengan jarum ose steril lalu disuspensikan dalam tabung yang berisi 10 ml larutan natrium
klorida 0,9, kemudian diinkubasi selama 2 jam, sampai didapat kekeruhan suspensi bakteri sama dengan kekeruhan suspensi standar Mc. Farland, berarti
konsentrasi suspensi bakteri adalah 10
8
CFUml. Setelah itu dilakukan pengenceran dengan memipet 0,1 ml suspensi bakteri 10
8
CFUml, dimasukkan ke dalam tabung steril dan ditambahkan larutan natrium klorida 0,9 sebanyak
9,9 ml dan dikocok homogen. Dari sini diperoleh suspensi bakteri dengan konsentrasi 10
6
CFUml.
3.8.5.2 Bakteri Escherichia coli
Dari stok kultur Escherichia coli yang telah tumbuh diambil dengan jarum ose steril lalu disuspensikan dalam tabung yang berisi 10 ml larutan natrium
klorida 0,9 kemudian diinkubasi selama 2 jam, sampai didapat kekeruhan suspensi bakteri sama dengan kekeruhan suspensi standar Mc. Farland, berarti
konsentrasi suspensi bakteri adalah 10
8
CFUml. Setelah itu dilakukan pengenceran dengan memipet 0,1 ml suspensi bakteri 10
8
CFUml, dimasukkan ke dalam tabung steril dan ditambahkan larutan natrium klorida 0,9 sebanyak
9,9 ml dan dikocok homogen. Dari sini diperoleh suspensi bakteri dengan konsentrasi 10
6
CFUml.
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
3.9 Pengenceran ekstrak etanol
Ditimbang ekstrak etanol daun bangun-bangun sebanyak 0,4 gram, lalu ditambahkan etanol hasil destilasi sampai 10 ml, sehingga didapat konsentrasi
ekstrak 4. Kemudian dilakukan pengenceran, hingga di dapat konsentrasi 3, 2, 1, 0,8, 0,5, 0,4, 0,3,0,2, 0,1.
3.10 Pengujian daya antibakteri 3.10.1 Pengujian daya antibakteri ekstrak etanol daun bangun-bangun
terhadap bakteri Staphylococcus aureus.
Sebanyak 20 ml Nutrien Agar dengan suhu 45-50 C dimasukkan ke
dalam tabung reaksi steril, lalu ditambahkan 0,1 ml inokulum ke dalam media, kemudian divorteks agar media dan suspensi bakteri tercampur merata, setelah itu
dituang media Nutrient Agar ke dalam cawan petri steril, dibiarkan memadat. Pada media yang telah padat, dilubangi dengan pencetak lubang punch hole lalu
diteteskan ekstrak etanol daun bangun-bangun masing-masing sebanyak 0,1 ml dengan berbagai konsentrasi, dibiarkan 15 menit, kemudian diinkubasi dalam
inkubator pada suhu 36 ± 1ºC selama 18-24 jam, setelah itu diukur diameter daerah hambatan zona jernih dengan menggunakan jangka sorong. Digunakan
etanol sebagai kontrol. Percobaan dilakukan sebanyak 3 kali.
3.10.2 Pengujian daya antibakteri ekstrak etanol daun bangun-bangun terhadap bakteri
Escherichia coli
Sebanyak 20 ml Nutrien Agar dengan suhu 45-50 C dimasukkan
ke dalam tabung reaksi steril, lalu ditambahkan 0,1 ml inokulum ke dalam media, kemudian divorteks agar media dan suspensi bakteri tercampur merata, setelah itu
dituang media Nutrient Agar ke dalam cawan petri steril, dibiarkan memadat.Pada
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
media yang telah padat dilubangi dengan pencetak lubang punch hole lalu diteteskan ekstrak etanol daun bangun-bangun masing-masing sebanyak 0,1 ml
dengan berbagai konsentrasi, dibiarkan 15 menit, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36 ± 1ºC selama 18-24 jam, setelah itu diukur diameter
daerah hambatan zona jernih dengan menggunakan jangka sorong. Digunakan etanol sebagai kontrol. Percobaan dilakukan sebanyak 3 kali.
3.11 Isolasi minyak kedelai 3.11.1 Pembuatan Minyak Kedelai
Kacang kedelai dibersihkan dari pengotor, kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender hingga menjadi pecahan kecil. Kemudian ditimbang
sebanyak 50 g, lalu dibungkus dengan kertas saring, dimasukkan ke dalam alat soklet ditambahkan pelarut n-heksana. Dipasang kondensor, lalu disokletasi
sampai filtrat tidak berwarna. Pemisahan minyak dan pelarut dapat dilakukan dengan menggunakan alat rotary evaporator vakum.
3.11.2 Pemurnian Minyak Kedelai 3.11.2.1 Degumming
Degumming dilakukan untuk untuk memisahkan fospolipid yang terhidrasi dari minyak. Minyak kedelai hasil sokletasi ditambahkan air suling 2 dari berat
minyak, aduk rata kemudian dipanaskan pada suhu 70 C selama 30 menit.
Campuran minyak disentrifugasi. Snyder Kwon, 1987.
3.11.2.2 Alkali Refining
Alkali refining dilakukan untuk memisahkan sabun yang terbentuk. Minyak kedelai hasil degumming ditambahkan NaOH 12 sebanyak 8 dari
jumlah minyak, aduk rata kemudian disentrifugasi. Kemudian minyak dicuci
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
dengan air yang telah dipanaskan pada suhu 94 C dan kemudian campuran
disentrifugasi Snyder Kwon, 1987.
3.11.2.3 Bleaching
Bleaching dilakukan untuk menghilangkanmemucatkan warna. Minyak kedelai hasil alkali refining ditambah karbon aktif sebanyak 1 dari berat
minyak, diaduk merata lalu disaring Snyder Kwon, 1987.
3.12 Pengujian daya antioksidan
Penentuan daya antioksidan dilakukan berdasarkan peningkatan bilangan peroksida. Aksi oksigen terhadap minyak kedelai ditentukan dengan
membandingkan nilai peroksida kontrol dengan nilai peroksida setelah penyimpanan selama 7 hari pada suhu 40
C. Ditimbang 0,5 g minyak kedelai, dimasukkan ke dalam wadah berwarna gelap, ditambahkan sebanyak 1 bb,
2 bb, 3 bb ekstrak etanol daun bangun-bangun. Diinkubasi pada suhu 40
C selama 7 hari. Peningkatan bilangan peroksida dapat dilihat dalam 7 hari pada penyimpanan selama 0, 3, 5, dan 7 hari. Kemudian diberi perlakuan yang
sama terhadap minyak kedelai kontrol tanpa penambahan ekstrak etanol daun bangun-bangun, minyak kedelai dengan penambahan BHT 0,02 bb Pohan,
2002. Minyak kacang kedelai hasil inkubasi pada suhu 40
C, dimasukkan dalam labu erlenmeyer, kemudian ditambah 10 ml kloroform, dihomogenkan dengan
pengocokan. Lalu ditambah 15 ml asam asetat glasial dan 0,5 ml kalium iodida jenuh. Tutup labu erlenmeyer dengan plastik dan goyang pelan selama 1 menit
dan biarkan lebih kurang 5 menit ditempat terlindung dari cahaya pada temperatur kamar. Kemudian ditambah 30 ml air suling, titrasi dengan Na
2
S
2
O
3
0,002 N
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
sampai berwarna kuning muda. Kemudian ditambah 0,5 ml indikator kanji, dan titrasi dilanjutkan sampai warna biru hilang Ronald, E.,2005.
Dari hasil titrasi yang diperoleh ditentukan angka peroksidanya yang dinyatakan sebagai meq oksigen aktif per-kg dengan rumus:
Bilangan Peroksida = Metode yang digunakan untuk menetukan daya antioksidan dari sampel
adalah metode Saito dan Ishihara Pohan, 2002. Daya antioksidan dihitung dari plot angka peroksida selama penyimpanan pada suhu 40
C selama penyimpanan 0, 3, 5, dan 7 hari. Daya antioksidan diperkirakan dengan membandingkan slope
linier dari minyak kedelai sebagai kontrol dengan plot angka peroksida minyak kedelai dengan penambahan ekstrak.
Aktivitas antioksidan =
c y
c
S S
S −
X 100 Keterangan:S
c
= Slope dari plot angka peroksida minyak kedelai kontrol S
y
= Slope dari angka peroksida minyak kedelai dengan penambahan ekstrak atau pembanding
Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
