Lieberman-Burchad, hasil uji positif jika terbentuk larutan berwarna hijau kebiruan pada sample.
5. Uji zat terpenoida dilakukan dengan menambahkan ekstrak jahe dengan kloroform, kemudian diambil filtratnya, ditambahkan pereaksi salkowsky
H
2
SO
4
, hasil positif jika terbentuk larutan merah pada sampel. 6. Uji zat saponin dilakukan dengan cara menambahkan ekstrak jahe
dengan akuades, lalu dikocok sampai terbentuk buih. Hasil uji positif jika buih yang dihasilkan setelah didiamkan selama 15 menit tetap ada
yang dihasilkan Lampiran C Harborne, 1987 dalam kelana, 2003, hlm : 17.
3.8. Prosedur Pelaksanaan Uji Pengaruh Pemberian Ekstrak Jahe
Sebelum percobaan, mencit jantan ditimbang dan di tempatkan dalam kandang tersendiri di dalam ruangan laboratorium aklimatisasi. Mencit dibagi secara
acak ke dalam 6 kelompok perlakuan, seperti yang ditunjukkan pada gambar 6 dan 7.
Gambar 6. Prosedur Pelaksanaan Uji Pengaruh Pemberian Ekstrak Jahe
HARI 0 7 8 9
37
AKLIMATISASI PENGAMBILAN
DATA AWAL PERLAKUAN
PADA HEWAN PENELITIAN
DEKAPITASI PEMBEDAHAN
Universitas Sumatera Utara
Gambar 7. Kerangka Operasional Percobaan Hari ke 8 - 38
3.9. Pengamatan
Setelah 30 hari perlakuan, masing-masing hewan coba dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah. Kemudian dilakukan pengamatan
sebagai berikut :
3.9.1 Pengamatan Kadar MDA Ginjal Mencit. Pemeriksaan kadar MDA ginjal mencit dilakukan pada hari ke-30 setelah perlakuan pada semua kelompok.
Ginjal dihomogenkan dengan 5 ml larutan buffer phosphate pH 7,2.
n = 4 n = 4 n = 4 n = 4 n = 4 n = 4
Kontrol + Kontrol + Kontrol + Kontrol + ekstrak jahe ekstrak jahe 0,5 ml Tween 80 Pb asetat ekstrak jahe ekstrak jahe 0,14 mgkg BB 0,28 mgkg BB
dalam 2 0,1 mgg BB 0,14 mgg BB 0,28 mgg BB
1 jam 1 jam
0,1 mgg BB 0,1 mgg BB Pb asetat Pb asetat
HARI 8
38 PERLAKUAN SELAMA HARI KE 30
PERLAKUAN PADA HARI KE 38 : Mencit didekapitasi
Dilakukan pemeriksaan kadar MDA ginjal Dilakukan pemeriksaan histopatologis tubulus proksimal ginjal
Kel.I Kel.II
Kel.III Kel.IV
Kel.V Kel.VI
I
Universitas Sumatera Utara
Metode pemeriksaan MDA menurut Rao et al., dalam Hsieh et al, 2006 yang telah dimodifikasi sebagai berikut :
a Reagensia : 1 2-thiobarbiturat acid Merek; Cat No. 1.08180.0025
2 1,1,3,3-terramethoxypropane 99 Sigma; Cat. No. 108383 500 µM 3 Acetic acid glacial
4 Sodium hydroxide NaOH 5 Aquades
b Persiapan Reagensia : 1. TBABuffer Reagent. TBABuffer Reagent terdidi dari : 0,67 g 2-
thiobarbituric acid dilarutkan dalam 100 mL aquadest, selanjutnya 0,5 gram sodium hydroxide dan 100 mL asam asetat glacial.
2. Standard MDA. Sebanyak 250 µL 1,1,3,3-tetramethoxypropane Malondialdehid bis 500 µM dilarutkan dalam 750 µL aquadest
untuk memperoleh larutan stok MDA 125 µM. Selanjutnya dari larutan stok MDA 125 µM dilarutkan dalam aquadest dan dibuat 8 seri
standar yang dapat dilihat pada table di bawah ini :
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4. Persiapan Standar MDA untuk Spektrofotometri Nomor Konsentrasi Volume Volume
Standar MDA µM MDA pelarut µL Standar µL
8 50 400 600 7 25 200 800
6 10 80 920 5 5 40 960
4 2,5 20 980 3 1,25 10 990
2 0,625 5 995 1 0 0 1000
c Prosedur uji : 1 Sebanyak 500 µL sample suspensi ginjal atau standar MDA
dimasukkan dalam tabung ependorf yang masing-masing telah diberi label.
2 Ditambahkan 0,5 ml aquades pada masing-masing tabung. 3 Kemudian ditambahkan 0,5 ml TBABuffer Reagent.
4 Selanjutnya masing-masing tabung diinkubasi di dalam water bath dengan suhu 95
C selama 60 menit. 5 Setelah diinkubasi, masing-masing tabung dikeluarkan dari waterbath
dan setelah dingin masing-masing tabung disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 10 menit.
Universitas Sumatera Utara
6 Supernatan diambil
untuk selanjutnya
dianalisa dengan
spektrofotometer UV pada panjang gelombang 534 nm.
3.9.2 Pengamatan Gambaran Mikroskopis Tubulus Proksimal Ginjal Mencit. Pengamatan mikroskopis tubulus proksimal ginjal mencit meliputi vakuolisasi
pada sitoplasma sel epitel tubulus, dan perubahan pada sel-sel pelapis epitel tubulus berupa degenerasi hidrofilik perubahan sel dan inti yang membengkak dan
nekrosis inti yang lisis .
a Prosedur uji: 1. Jaringan ginjal yang diambil segera difiksasi dalam larutan
formalin 10. 2. Dehidrasi dengan memakai alkohol 70 ke 100.
3. Penjernihan dengan memakai toluene. 4. Impregnasi mamasukkan ke lilin cair.
5. Pembuatan block parafin penanaman sampel jaringan. 6. Dipotong dengan mikrotom setebal 3 µm.
7. Potongan lilin beserta jaringan dimasukkan ke dalam water bath 8. Jaringan diletakkan di objek glas.
9. Pencairan lilin yang melekat di sample jaringan. 10. Deparafinisasi memakai xylol.
11. Rehidrasi dengan memakai alkohol 96 ke 80.
Universitas Sumatera Utara
12. Bersihkan dengan air mengalir. 13. Pewarnaan jaringan dengan Hematoksilin.
14. Bersihkan dengan air mengalir. 15. Celupkan ke dalam HCl 2.
16. Bersihkan dengan air mengalir. 17. Celupkan kedalam larutan amoniak.
18. Bersihkan dengan air mengalir. 19. Dehidrasi memakai alkohol 96.
20. Masukkan kedalam larutan eosin. 21. Celupkan kedalam alkohol 96 3X.
22. Masukkan kedalam larutan xylol 2X. 23. Tutup objek glas dengan dek glas memakai Balsem Mounting.
24. Sisa xylol dibuang, ditetesi etilen. 25. Pemeriksaan histopatologis dengan menggunakan mikroskop cahaya
pembesaran 400X.
Sasaran yang dibaca adalah perubahan struktur histologis tubulus kontortus proksimal ginjal mencit, karena sel epitel tubulus proksimal mencit merupakan
tempat absorbsi dan mengkonsentrasikan racun Rubin E, 2009.
Setiap mencit dibuat preparat ginjal dan tiap preparat dibaca dalam 5 lapangan pandang yaitu ke empat sudut dan bagian tengah preparat dengan pembesaran 400x
Universitas Sumatera Utara
dengan batasan jumlah 20 sel tiap lapangan pandang Al-Munawar NM, 2009, kemudian disesuaikan pada derajat kerusakan 0,1,2 atau 3 selanjutnya dicari rata-
ratanya di 5 lapangan pandang.
b Derajat kerusakan tubulus proksimal ginjal ditetapkan berdasarkan : 1. Kriteria normal bila tidak diketemukan:
a. Perubahan sel dan inti yang membengkak degenerasi hidrofilik.
b. Inti yang lisis nekrosis.
2. Derajat kerusakan tubulus proksimal : 0 = Tidak ditemukan kriteria di atas
1 = Bila ditemukan kriteria a 2 = Bila ditemukan kriteria a dan b
3 = Bila ditemukan kriteria b hampir semua lapangan pandang
3.10. Analisa Data dan Pengujian Hipotesis
