35
Dengan demikian, berdasarkan data penelitian Kotle dkk tahun 2012, minimal besar sampel pada penelitian ini sebanyak 55 orang untuk setiap kelompok. Pada
penelitian ini terdapat 4 variabel yang mempengaruhi kadar protein total saliva yang tidak dapat dikontrol dengan kriteria eksklusi, sehingga berdasarkan rule of
ten yaitu jumlah variabel yang mempengaruhi kadar protein total saliva yang tidak
dapat diekskusi dikalikan degan 10, dibutuhkan 40 sampel untuk setiap kelompok. Untuk menentukan besar sampel pada penelitian ini adalah dengan
membandingkan antara jumlah besar sampel berdasarkan rumus besar sampel penelitian analitik dan dengan rule of ten, lalu diambil angka sampel terbesar,
sehingga pada penelitian ini besar sampel yang dubutuhkan adalah 55 sampel untuk setiap kelompok.
3.5 Alat dan Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan antara lain saliva perokok dan non- perokok; pengawet protein PSMF; reagen Bradford; protein standar BSA Bovine
Serum Albumine 2000 μgmL; buffer atau pelarut PBS Phosphate Buffered
Saline ; dan aluminium foil.
Alat penelitian yang digunakan antara lain botol sampel; coolbox berisi es batu; centrifuge; microplate 96 plate well; alat vortex; alat spin down; plate
shaker ; microplate reader; micro pippette dan tip; dan multichannel pipette.
3.6 Cara Kerja Penelitian
Menentukan subjek penelitian sesuai dengan kriteria inklusi
Mendapatkan informed consent dari subjek penelitian, pengisian kuisioner
serta memberikan penjelasan kepada subjek mengenai prosedur pengambil saliva
Pemeriksaan gigi dan mulut responden untuk mengetahui status DMFT
decayed, missing, filled teeth score, GI gingival index, PI plaque index, DI debri index, CI calculus index, dan OHIS oral higie
ne index simplified , dilakukan oleh dokter gigi pembimbing.
36
Gambar 3.1. Pemeriksaan Gigi dan Mulut Subjek
Pengambilan sampel saliva sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam botol sam pel. Saliva dikumpulkan antara pukul 09.00-11.00 pagi untuk meminimalis
ir efek sirkadian dan kurang-lebih 2jam setelah subjek makan dan mencuci mulut. Sampel saliva langsung dimasukkan ke dalam coolbox berisi es.
Sampel di sentrifugasi pada 3000 rpm selama 5 menit.
Gambar 3.2. Sentrifugasi Sampel Saliva
Lalu bagian supernatannya diambil sebanyak 900 μl, ditambahkan PSMF 100
μl sebagai pengawet protein, dan disimpan dalam suhu -20
o
C hingga waktu pengujian.
Gambar 3.3. Larutam PSMF
Melakukan uji kadar protein total menggunakan Bradford assay -
Membuat larutan standar kaliberasi yaitu 2000 μgml BSA
37
Bovine Serum Albumine dalam pelarut PBS, dilakukan 6 kali pengen ceran menggunakan 7 tube dengan cara: mengisi tube kedua hingga
ketujuh. -
Lalu diambil 50 μl BSA dari tube pertama ke tube kedua, setelah itu tube kedua di vortex. Lalu diambil 50
μl dari tube kedua ke tube ketiga setelah itu tube ketiga di vortex dan di spin down. Begitu seterusnya hi
ngga tube ketujuh. Dihasilkan 7 tube larutan standar pada konsentrasi 2000
μgml, 1000 μgml, 500 μgml, 250 μgml, 125 μgml, 62.5 μgm, dan 31.25
μgml.
Gambar 3.4. Alat Vortex -
Memasukkan 10 μl larutan standar kaliberasi di atas ke dalam microplate
dari sumur pertama hingga ketujuh. Sumur kedelapan diisi dengan 10
μl PBS sebagai kontrol pelarut. -
Memasukkan masin-masing 10 μl hasil sentrifugasi sampel saliva ke d alam sumur microplate lainnya.
Gambar 3.5. Microplate -
Menambahkan 200 μl reagen Bradford ke dalam 10 μl larutan standar d dan samel pada microplate menggunakan multichannel pipette. Kem
udian dicampur dengan plate shaker selama 30 detik, lalu diinkubasi
38
selama 10 menit pada suhu ruangan.
Gambar 3.6. Reagent Bradford -
Dilihat perubahan warna yang terjadi dari coklat menjadi biru.
Gambar 3.7. Perubahan Warna Sampel Protein - Diukur absorbansinya dalam microplate reader dengan panjang gelombang 595
nm.
Gambar 3.8. Microplate Reader -
Menentukan konsentrasi protein total dengan cara bradford assay sesuai protokol yang tertulis pada kemasan.
3.7 Managemen dan Analisis Data
