3.3 Isolasi Jamur
Colletotrichum
sp
Isolat jamur
Colletotrichum
sp. diisolasi dari daun kakao. Daun kakao yang bergejala di sterilisasi ke dalam larutan Alkohol 70 selama beberapa detik selanjutnya
direndam dalam larutan sodium hipoklorit 1 selama lima menit. Jaringan yang steril dicuci dengan aquades dan ditumbuhkan pada media PDA. Jamur yang tumbuh diisolasi
dan semua biakan dimurnikan untuk mendapat satu koloni jamur
Colletotrichum
sp.
3.4 Uji Antagonisme Bakteri Kitinolitik In vitro
Kemampuan bakteri kitinolitik dalam menghambat pertumbuhan diuji secara in vitro. Biakan kultur
Colletotrichum
sp.diambil dengan cork borer, selanjutnya diinokulasi pada bagian tengah media agar MGMC dengan jarak 3,5 cm dari cakram standard Oxoid
yang berdiameter 5 mm tempat inokulan bakteri. Selanjutnya suspensi bakteri kitinolitik dengan konsentrasi 10 µl ≈10
8
selml diinokulasikan pada cakram tersebut. Biakan selanjutnya diinkubasi pada suhu 30
°
C. Zona hambat terhadap miselia
Colletotrichum
sp. diamati mulai hari kedua sampai hari ketujuh. Pengukuran zona hambat bakteri terhadap
fungi yaitu panjang koloni fungi normal tidak terhambat dikurang panjang koloni yang terhambat oleh bakteri kitinolitik Martorejo
et al
., 2001.
3.5 Pengamatan Struktur Hifa Fungi Abnormal
Pengamatan dilakukan dengan 2 cara yaitu yaitu secara visual dan mikroskopis. Pengamatan secara visual dilakukan dengan cara melihat zonaluas pertumbuhan miselium
Colletotrichum
sp. Pengamatan secara mikroskopis dilakukan dengan cara mengamati ujung miselium pada daerahzona hambat
Colletotrichum
sp. Ujung miselium
Colletotrichum
sp. yang tumbuh pada permukaan media PDA dipotong berbentuk
block square
. Kemudian diletakkan pada objek gelas. Selanjutnya diamati adanya abnormalitas pertumbuhan miselium
Colletotrichum
sp., berupa pembengkokan ujung miselium,
Universitas Sumatera Utara
miselium pecah, miselium berbelah, miselium bercabang, miselium lisis dan miselium tumbuh kerdil Lorito
et al.
, 1992.
3.6 Perbanyakan Suspensi Bakteri dan Jamur
Pembuatan suspensi bakteri dilakukan menurut metode Bressan Borges 2003. Biakan bakteri disubkultur dalam media NA dan diinkubasi ± 2 hari. Hasil subkultur
biakan bakteri diambil dengan jarum ose dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml akuades steril. Setelah dihomogenkan dengan cara divortex dan disamakan
kekeruhannya dengan standard Mac Farland sehingga diperoleh suspensi bakteri dengan kerapatan sel
10
8
CFUml. Jamur disubkultur pada media PDA, selanjutnya konidia jamur
Colletotrichum
sp. yang terbentuk diambil dengan cara sebagai berikut: biakan murni konidia
Colletotrichum
sp., ditetesi dengan aquadest steril sebanyak 10 ml kemudian dikikis dengan jarum kait sehingga konidia yang ada terlepas dalam aquadest steril. Campuran ini disaring dengan
kain muslin sehingga potongan-potongan miselium dan bagian yang kasar dari media akan tertinggal dan hanya konidia saja yang dapat lewat.
Filtrat selanjutnya dikocok 1000 rpm selama 30 menit untuk mendapatkan suspensi konidia yang konsentrat. Kerapatan konidia dalam suspensi dihitung dengan
menggunakan haemocytometer. Suspensi konidia ini diencerkan dengan menggunakan aquadest steril sehingga mencapai kerapatan 2 x 10
5
konidia per ml.
Universitas Sumatera Utara
3.7 Pengamatan Intensitas Serangan