Tabel III. Komposisi dan konsentrasi reagen ALT
R1: TRIS pH 7.65
11 mmolL L-Aspartate
320 mmolL MDH
malate dehydrogenase
≥ 800 UL
LDH lactate dehydrogenase
≥ 1200 UL
R2: 2-Oxoglutarate
65 mmolL NADH
1 mmolL Pyridixal-5-phosphate FS:
Good’s buffer pH 9.6 100 mmolL
Pyrodoxal-5-phosphate 13 mmolL
D. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: panci infusa, termometer, sendok, stopwatch, gelas beker, gelas ukur, labu ukur, cawan
porselen, batang pengaduk, penangas air, timbangan analitik, kain flanel, moisture balance, tabung reaksi, spuit injeksi p.o untuk tikus, spuit injeksi i.p, pipa kapiler,
mikro pipet, blue tip, yellow tip, mikrolab 200, stopwatch, vortex, sentrifuge, Eppendorf.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi serbuk biji P. americana Mill.
Serbuk kering biji P. americana Mill. dari Padang, Sumatera Barat dibandingkan secara mikroskopik dengan serbuk kering biji P. americana Mill.
standar. Bila penampakan mikroskopik kedua serbuk sama, maka dapat dipastikan serbuk tersebut merupakan serbuk biji P. americana Mill. Determinasi dilakukan
oleh Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Penetapan kadar air serbuk kering biji P. americana Mill.
Serbuk kering biji P. americana Mill. yang sudah diayak, dimasukkan ke dalam alat moisture balance sebanyak 5,0 g kemudian diratakan. Bobot serbuk
kering biji tersebut ditimbang sebagai bobot sebelum pemanasan bobot A, setelah itu dipanaskan pada suhu 105
o
C. Serbuk kering biji P. americana Mill. yang sudah dipanaskan ditimbang kembali dan dihitung sebagai bobot setelah
pemanasan bobot B. Kemudian dilakukan perhitungan terhadap selisih bobot A dan bobot B yang merupakan kadar air serbuk biji P. americana Mill.
3. Pembuatan dekok biji P. americana Mill.
Serbuk kering biji P. americana Mill. ditimbang sebanyak 8,0 g,
dimasukkan ke dalam panci infusa dan dibasahi dengan 16 mL aquadest, lalu ditambah dengan 100,0 mL aquadest. Selanjutnya dilakukan pemanasan dengan
suhu 90
o
C selama 30 menit. Waktu 30 menit dihitung ketika suhu campuran
mencapai 90
o
C. Setelah 30 menit, campuran tersebut diambil dan diperas
ditambahkan aquadest melalui ampas serbuk biji P. americana Mill. yang terdapat
pada kain flanel hingga diperoleh volume 100 mL.
4. Penetapan dosis dekok biji P. americana Mill.
Penelitian ini menggunakan tiga peringkat dosis dekok biji P. americana Mill. yang diberikan secara p.o. Dosis
360,71 mgkgBB
merupakan dosis rendah, dosis
642,06 mgkgBB
merupakan dosis tengah, dan dosis
1142,86 mgkgBB
merupakan dosis tinggi. menggunakan kain flanel. Bila volume yang didapatkan kurang dari 100 m
, maka
5. Pembuatan larutan karbon tetraklorida konsentrasi 50
Larutan karbon tetraklorida dibuat dalam konsentrasi 50 dimana perbandingan volume karbon tetraklorida dan pelarut adalah 1:1 Janakat dan Al-
Merie, 2002. Larutan karbon tetraklorida dibuat dengan cara dilarutkan dengan volume yang sama dengan olive oil.
6. Uji pendahuluan
a. Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida Pemilihan dosis karbon tetraklorida dilakukan untuk mengetahui
pada dosis berapa karbon tetraklorida mampu menyebabkan kerusakan hati tikus yang ditandai dengan peningkatan aktivitas serum ALT dan AST
paling tinggi. Dosis hepatotoksik yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada penelitian Janakat dan Al-Merie 2002 serta Windrawati
2012 bahwa dosis 2 mLkg BB terbukti mampu meningkatkan aktivitas ALT dan AST serum pada tikus bila diberikan secara i.p.
b. Penetapan waktu pencuplikan darah Untuk mendapatkan waktu pencuplikan darah dilakukan orientasi
dengan tiga ekor tikus. Setiap ekor tikus diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata menggunakan pipa kapiler pada jam ke-0, 24, dan 48
setelah pemejanan karbon tetraklorida. Kemudian diukur aktivitas serum ALT dan AST.
7. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Sejumlah tiga puluh lima ekor tikus dibagi secara acak ke dalam tujuh
kelompok perlakuan masing-masing sejumlah lima ekor tikus.
a. Kelompok I kontrol hepatotoksin diberi larutan karbon tetraklorida : olive oil 1:1 dosis 2 mLkgBB secara i.p.
b. Kelompok II kontrol negatif diberi olive oil dosis 2 mLkgBB secara i.p. c. Kelompok III kontrol positif diberi Curliv
®
plus syrup dosis 4,05 mLkgBB.
d. Kelompok IV kontrol dekok diberi dekok biji P. americana Mill. dosis tinggi
1142,86 mgkgBB
selama enam hari berturut-turut secara p.o. e. Kelompok V dosis rendah diberi dekok biji P. americana Mill. dosis
360,71 mgkgBB
secara p.o sekali sehari selama enam hari berturut-turut. f. Kelompok VI dosis tengah diberi dekok biji P. americana Mill. dosis
642,06 mgkgBB
secara p.o sekali sehari selama enam hari berturut-turut. g. Kelompok VII dosis tinggi diberi dekok biji P. americana Mill. dosis
1142,86 mgkgBB
secara p.o sekali sehari selama enam hari berturut-turut. Pada hari ke tujuh kelompok III, V, VI dan VII diberi larutan karbon
tetraklorida dosis 2 mLkgBB secara i.p. Setelah 24 jam diambil darahnya melalui
8. Pembuatan serum
Darah diambil melalui bagian sinus orbitalis mata tikus, kemudian ditampung dalam tabung Eppendorf. Darah didiamkan selama 15 menit. Darah
disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 10000 rpm dan bagian supernatannya diambil menggunakan mikro pipet.
sinus orbitalis mata,
ODOXdiukur aktivitas serum ALT dan AST.
9. Pengukuran aktivitas ALT dan AST serum
Alat yang digunakan untuk menganalisis aktivitas serum ALT dan AST adalah Mikrolab 200 Merck
®
. Aktivitas enzim dinyatakan dengan satuan Ul. pengukuran aktivitas serum ALT dan AST dilakukan di laboratorium Biokimia-
Anatomi Fisiologi Manusia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
a. Penetapan aktivitas serum kontrol Bertujuan untuk validitas dan reliabilitas alat yang digunakan. Analisis
dilakukan dengan cara mencampur 10 00 μL reagen I dengan 100 μL serum
kontrol TruLab N rentang nilai 26,2-41,8 Ul untuk ALT dan 35,4-56,6 Ul untuk AST . Campuran divortex selama lima detik dan didiamkan selama dua
menit. Setelah itu, ditambahkan 25 0 μL reagen II, divortex selama lima detik,
dan serapan dibaca setelah satu menit. b. Penetapan aktivitas serum ALT dan AST
Analisis serum ALT dan dilakukan dengan cara mencampur 10 00 μL
reagen I dengan 100 μL serum. Campuran divortex selama lima detik dan
didiamkan selama dua menit. Setelah itu, ditambahkan 25 0 μL reagen II,
divortex selama lima detik, dan serapan dibaca setelah satu menit. Untuk analisis serum AST dan dilakukan dengan cara mencampur 10
00 μL reagen I dengan 100
μL serum. Campuran divortex selama lima detik dan didiamkan selama dua menit. Setelah itu, ditambahkan 25
0 μL reagen II, divortex selama lima detik, dan serapan dibaca setelah satu menit.
F. Tata Cara Analisis Hasil
Data aktivitas serum ALT dan AST diuji dengan Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui distribusi data dan analisis varian untuk melihat homogenitas
varian antar kelompoknya sebagai syarat analisis parametrik. Jika data terdistribusi normal dan homogen maka dilanjutkan dengan analisis variansi pola
searah one way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan masing-masing kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe
untuk melihat perbedaan antar kelompok bermakna signifikan p ≤ 0,05 atau
tidak bermakna tidak signifikan p 0,05. Bila distribusi data tidak normal atau variansi tidak homogen, dilakukan analisis dengan Kruskal Wallis untuk
mengetahui perbedaan aktivitas serum ALT dan AST antar kelompok. Kemudian dilanjutkan uji dengan Mann Whitney untuk melihat perbedaan antar kelompok
bermakna signifikan p ≤ 0,05 atau tidak bermakna tidak signifikan p
0,05.
Perhitungan persen efek hepatoprotektif terhadap hepatotoksin karbon tetraklorida diperoleh dengan rumus:
� � �
4
− � �
� � � − � �
� −
� � � � �
� � �
4
− � �
� � � � 100
31
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian dan besar dosis optimum hepatoprotektif dekok biji P. americana Mill. pada tikus jantan
galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida. Dosis optimum merupakan dosis yang mampu menurunkan aktivitas serum ALT dan AST pada tikus terinduksi karbon
tetraklorida, hingga aktivitas serum sama dengan aktivitas serum ALT dan AST kontrol negatif olive oil. Tolok ukur hepatoprotektif dekok biji P. americana Mill.
dievaluasi secara kuantitatif berdasarkan uji enzim serum ALT dan AST. Uji enzim serum dilakukan dengan metode GPT-ALAT untuk mengukur serum ALT
dan metode GOT-ASAT untuk mengukur serum AST. Kemampuan dekok biji P. americana Mill. sebagai hepatoprotektor dapat dilihat dari daya hambatnya
terhadap kenaikan aktivitas serum ALT dan AST kelompok perlakuan dibandingkan dengan kontrol hepatotoksin karbon tetraklorida. Semakin besar
penurunan aktivitas serum ALT dan AST, maka semakin baik kemampuan dekok biji P. americana Mill. sebagai hepatoprotektor.
A. Penyiapan Bahan
1. Hasil determinasi tanaman
Pada penelitian ini digunakan serbuk biji P. americana Mill. sebagai bahan uji. Tujuan dari determinasi tanaman adalah untuk membuktikan bahwa
bagian dari tanaman yang digunakan benar berasal dari tanaman P. americana
