4.4 Analisa Kuantitatif
Analisis secara kuantitatif ditentukan dari kurva kalibrasi antibiotika baku berdasarkan luas puncak. Kurva kalibrasi antibiotika baku dibuat dengan
konsentrasi antibiotika baku yang meningkat dari rentang konsentrasi 0,01 ppm; 0,02 ppm; 0,04 ppm; 0,06 ppm; 0,08 ppm; 0,1 ppm; 1 ppm. Kurva linieritas
kalibrasi campuran antibiotika dapat dilihat pada lampiran dan data kalibrasi dapat dilihat pada tabel 4.5.
Tabel 4.5. Data hasil linieritas antibiotika baku. Antibiotika
Slope Rasio AreaKonsentrasi
R Koefisien Korelasi Amoksisilin
Y= 144509,97 X + 1341,13 0,9995
Tetrasiklin Y= 233367,08 X + 1292,30
0,9990 Ampisislin
Y= 172542,97 – 6964,78 0,9997
Kloramfenikol Y= 422755,92 X – 5227,28
0,9992
Dari kurva kalibrasi diperoleh hubungan yang linier antara luas puncak dan konsentrasi dengan koefisien korelaasi, r = 0,9995 untuk amoksisilin, r =
0,9990 untuk tetrasiklin, r = 0,9998 dan r = 0,9992 untuk kloramfenikol. Berdasarkan rekomendasi dari CDER Center for Drug Evaluation and Research,
US FDA merekomendasikan bahwa untuk prosedur analitika kriteria linieritasnya pada tingkat koefisien korelasi tidak lebih kecil dari 0,999 Ahuja dan Dong,
2005.
4.5 Hasil Uji Validasi Metode
Proses identifikasi untuk mengetahui bahwa hasil yang diperoleh adalah benar senyawa antibiotika yang dimaksud maka dilakukan tehnik spiking yaitu
menambahkan sedikit larutan baku antibiotika ke dalam larutan sampel yang
Universitas Sumatera Utara
diduga mengandung antibiotika, kemudian dianalisis pada kondisi yang sama. Hasil analisis menunjukkan bahwa terjadi peningkatan pada luas dan tinggi
puncak antibiotika yang diamati sebelumnya. Jadi dapat disimpulkan bahwa puncak yang diamati dalam larutan sampel adalah benar merupakan kromatogram
antibiotika. Kromatogram larutan sampel sebelum dan setelah di spiking dapat dilihat pada gambar 4.3a dan gambar 4.3 b.
a.
b.
Gambar 4.3. Kromatogram hasil penyuntikan larutan sampel daging ayam dan sampel daging ayam yang telah di spike dengan antibiotika baku dengan pola
ionisasi positif a; kromatogram hasil penyuntikan larutan sampel daging ayam dan sampel daging yang telah di spike dengan antibiotika baku dengan pola
ionisasi negatif b.
a b
c Ket:
a. Sampel dispike larutan standar amoksisilin
b. Sampel dispike larutan standar tetrasiklin
c. Sampel mengandung tetrasiklin
Ket: a.
Sampel dispike larutan standar ampisilin b.
Sampel dispike larutan standar kloramfenikol c.
Sampel mengandung kloramfenikol
a b
c Waktu Menit
Waktu Menit
Universitas Sumatera Utara
Uji validasi dilakukan untuk untuk mengetahui apakah alat, metode dan system KCKT-MS yang digunakan dapat memberikan hasil yang baik. Uji
validasi yang dilakukan pada metode ini adalah metode dengan parameter kecermatan accuracy, keseksamaan precision, batas deteksi LOD dan batas
kuantitasi LOQ. Uji kecermatan dinyatakan dengan persen perolehan kembali recovery yang dilakukan dengan metode penambahan baku standard
addition method yang mana sampel ditambahkan antibiotika baku yang jumlahnya 100 dari jumlah antibiotika yang terkandung didalamnya, masing-
masing dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Uji keseksamaan
dinyatakan dengan simpangan baku relatif RSD. Hasil perolehan kembali antibiotika dalam sampel dapat di lihat pada tabel 4.6.
Tabel 4.6. Data Hasil Uji Validasi dengan Metode Penambahan Baku A Amoksisilin; B Tetrasiklin; C Ampisilin; D Kloramfenikol.
a. Amoksisilin
No. Luas area
Konsentrasi µgg Analit yang
Ditambahkan µgg
Perolehan kembali
Setelah penambahan
Analit Sebelum
penambahan analit
1 6478,81
0,1765 0,0000
0,2000 88,25
2 7018,30
0,1958 0,0000
0,2000 97,90
3 7433,02
0,2080 0,0000
0,2000 104,00
4 7292,73
0,2020 0,0000
0,2000 101,00
5 7234,12
0,2007 0,0000
0,2000 100,35
6 7010,69
0.1956 0,0000
0,2000 97,30
Rerata perolehan kembali 98,13
Simpangan baku SD 3,1787
Simpangan baku relatif RSD 2,8827
Universitas Sumatera Utara
Tabel. 4.6, Sambungan. b.
Tetrasiklin No.
Luas area Konsentrasi µgg
Analit yang ditambahkan
µgg Perolehan
kembali Setelah
penambahan analit
Sebelum penambahan
analit 1
19818,40 0,3940
0,2248 0,2000
84,60 2
19553,40 0,3901
0,2248 0,2000
82,65 3
19790,50 0,3912
0,2248 0,2000
83,20 4
19337,00 0,3793
0,2248 0,2000
77,25 5
19696,70 0,3882
0,2248 0,2000
81,70 6
19082,30 0.3801
0,2248 0,2000
77,65 Rerata perolehan kembali
81,17 Simpangan baku SD
0,7588 Simpangan baku relatif RSD
0,9195
c. Ampisilin
No. Luas Area
Konsentrasi µgg Analit yang
ditambahkan µgg
Perolehan kembali
Setelah penambahan
analit Sebelum
penambahan analit
1 8904,67
0,4365 0,0000
0,5000 87,30
2 8665,29
0,4295 0,0000
0,5000 85,90
3 8864,92
0,4353 0,0000
0,5000 87,06
4 8877,41
0,4357 0,0000
0,5000 87,14
5 8617,87
0,4281 0,0000
0,5000 85,62
6 8827,85
0,4343 0,0000
0,5000 86,86
Rerata perolehan kembali 86,65
Simpangan baku SD 0,7068
Simpangan baku relatif RSD 0,8156
d. Kloramfenikol
No. Luas area
Konsentrasi µgg Analit yang
ditambahkan µgg
Perolehan kembali
Setelah penambahan
analit Sebelum
penambahan analit
1 77071,40
1,1259 0,6223
0,6000 83,93
2 82935,20
1,1338 0,6223
0,6000 85,25
3 84194,80
1,1260 0,6223
0,6000 83,95
4 84062,40
1,1672 0,6223
0,6000 90,81
5 76727,30
1,1461 0,6223
0,6000 87,30
6 83354,30
1,1493 0,6223
0,6000 87,33
Rerata perolehan kembali 86,43
Simpangan baku SD 1,6959
Simpangan baku relatif RSD 1,9823
Universitas Sumatera Utara
Tabel di atas menunjukan bahwa rerata persen perolehan kembali yang didapat telah memenuhi syarat akurasi karena rerata persen perolehan kembali
berada diantara rentang 80-120 Ermer dan Miller, 2005. Presisi Prosedur penelitian dinyatakan dalam simpang.an baku relatif
RSD. Simpangan baku relatif yang diperoleh dari hasil pengujian akurasi adalah 2,8827 amoksisilin; 0,9195 tetrasiklin; 0,8156 ampisilin; 1,9823
kloramfenikol. Prosedur dalam penelitian ini memiliki presisi yang cukup baik karena simpangan baku relatif yang diperoleh telah memenuhi syarat yakni kecil
dari 5 Rohman, 2007. Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung dari persamaan regresi yang
diperoleh dalam kurva kalibrasi. Batas deteksi yang diperoleh pada penelitian ini adalah 0,0376 µgml amoksisilin; 0,0576 µgml tetrasiklin; 0,0925 µgml
ampisilin; 0,0489 µgml kloramfenikol sedangkan batas kuantitasi yang diperoleh berturut-turut adalah 0,1141 µgml amoksisilin; 0,1745 µgml
tetrasiklin; 0,2803 µgml ampisilin; 0,1484 µgml kloramfenikol. Dari data hasil penelitian diatas disimpulkan bahwa prosedur analisis
dalam penelitian ini dapat digunakan untuk penetapan kadar antibiotika amoksisilin, tetrasiklin, ampisilin dan kloramfenikol dalam sampel daging ayam
karena telah memenuhi persyaratan validasi metode.
4.6 Penetapan Kadar Antibiotika dalam Sampel Daging Ayam.
Kategori