4.3 Penentuan Kondisi KCKT Yang Optimum
Analisa antibiotika amoksisilin, tetrasiklin, ampisilin dan kloramfenikol dalam daging telah dilakukan berdasarkan metode yang telah dilakukan oleh Zhou
2010 dengan menggunakan fase gerak asam formiat 0,1 dalam akuabides dan asam formiat 0,1 dalam metanol dengan elusi gradient seperti pada tabel 4.2.
Elusi gradien adalah tehnik elusi fase gerak dengan kondisi perbandingan komposisi fase gerak di atur berubah selama waktu analisa McMaster, 2007.
Tabel 4.2. Pola fase gerak pada kondisi KCKT Waktu
min Laju alir
mlmin 0,1 asam
formiat dalam air 0,1 asam
formiat dalam methanol
0,0 0,5
98 2
0,3 0,5
98 2
7,27 0,5
20 80
7,37 0,5
1 99
8,27 0,5
1 99
13 0,5
98 2
Hasil kromatografi memperlihatkan kromatogram yang tajam dan garis dasar yang stabil pada gambar 5 disebabkan penggunaan metanol dan asam
formiat sebagai fase gerak. Menurut Cai- Ming 2009 bahwa penggunaan fase gerak berupa senyawa organik metanol dengan penambahan asam formiat 0,1
vv berguna untuk meningkatkan intensitas respon dan membantu dalam meningkatkan bentuk puncak menjadi lebih tajam dan untuk menjadi sumber
proton dalam proses ionisasi di detektor MS.
Universitas Sumatera Utara
a.
b.
Gambar 4.2. Kromatogram hasil optimasi penyuntikan larutan 1 ppm larutan antibiotika baku standar dengan pola ionisasi positif a dan pola
ionisasi negatif b.
h
c e
f g
b a
Ket: a.
Ampisilin 55:45 b.
Ampisilin 60:40 c.
Ampisilin 65:35 d.
Ampisilin 70:30 e.
Kloramfenikol 55:45 f.
Kloramfenikol 60:40 g.
Kloramfenikol 65:35 h.
Kloramfenikol 70:30 d
d e
f g
h a
b,c Ket:
a. Amoksisilin 50:50
b. Amoksisilin 40:60
c. Amoksisilin 30:70
d. Amoksisilin 20:80
e. Tetrasiklin 50:50
f. Tetrasiklin 40:60
g. Tetrasiklin 30:70
h. Tetrasiklin 20:80
Waktu Menit
Waktu Menit
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.3. Data hasil waktu tambat a, lempeng teoritis b, tailing factor c analisis antibiotika baku standar pada berbagai perbandingan komposisi fase
gerak dan laju alir 0,5 mlmnt. a.
Perbandingan Fase Gerak pada menit ke
7,27 Waktu Tambat Menit
Pos Neg
Amoksisilin Tetrasiklin
Ampisilin Kloramfenikol A
B A
B 50
50 70
30 4,692
7,157 2,235
4,748 40
60 65
35 4,491
6,629 1,640
4,003 30
70 60
40 4,487
6,354 1,314
3,134 20
80 55
45 4,342
6,031 1,099
2,375 b.
Perbandingan Fase Gerak pada menit ke
7,27 Lempeng Teoritis Theoritical plate
Pos Neg
Amoksisilin Tetrasiklin
Ampisilin Kloramfenikol A
B A
B 50
50 70
30 6704
9991 1496
4720 40
60 65
35 6767
9797 1082
2162 30
70 60
40 11027
13382 899
1120 20
80 55
45 10881
12952 731
920
c. Perbandingan Fase
Gerak pada menit ke 7,27
Tailing Factor
Pos Neg
Amoksisilin Tetrasiklin
Ampisilin Kloramfenikol A
B A
B 50
50 70
30 1.45
1,89 1,65
1,55 40
60 65
35 1,42
1,76 1,59
1,41 30
70 60
40 1,44
1,81 1,62
1,43 20
80 55
45 1,40
1,80 1,55
1,54 Keterangan: A : 0,1 asam formiat dalam air
B: 0,1 asam formiat dalam metanol
Universitas Sumatera Utara
Hasil penelitian yang dilakukan oleh Zhou 2010, dengan menggunakan kolom kromatografi C18 dengan ukuran 50 x 2,1 mm x 2,6 µm memberikan
waktu tambat untuk amoksilin 2,08 menit, tetrasiklin 3,71 menit , ampisilin 3,56 menit dan kloramfenikol 4,28 menit tetapi karena kolom kromatografi yang
digunakan pada penelitian adalah kolom C18 dengan ukuran 4,6 x 30 mm x 1.8 µl maka, pada penelitian ini dilakukan optimasi pada fase gerak untuk mendapatkan
efisiensi kolom dan pemisahan yang baik. Optimasi fase gerak dilakukan pada perbandingan fase gerak 0,1 asam formiat dalam metanol pada menit 7,27.
Data analisa campuran amoksisilin, tetrasiklin, ampisilin dan kloramfenikol baku dengan KCKT-MS menggunakan berbagai komposisi fase gerak pada laju alir 0,5
mlmenit dapat dilihat pada tabel 4.3 kromatogram dapat dilihat pada gambar 4.2a dan 4.2b.
Dari tabel 4.3a, dapat diamati bahwa semakin besar konsentrasi metanol dalam fase gerak, maka waktu tambat akan semakin singkat. Namun, waktu
tambat yang singkat tidak selalu menjadi yang terbaik terutama untuk sampel dalam matriks biologis Purcell, 2009. Hal ini dikarenakan sering muncul
puncak-puncak lain pada menit-menit awal yang akan mengganggu pengamatan. Schluesener 2006 menyatakan bahwa puncak kromatogram dalam
kondisi ideal memperlihatkan bentuk Gaussian dengan asimetris tailing factor bernilai 1 dan nilai asimetris tidak lebih besar dari 2 karena akan memberikan
bentuk tailing sehingga nilai asimetris yang terbaik adalah yang mendekati 1. Efisiensi kolom pada KCKT dapat dilihat dari parameter lempeng teoritis pada
setiap kromatogram dan daya pisah dapat dilihat dari parameter resolusi.
Universitas Sumatera Utara
Menurut USP XXX, lempeng teoritis setiap kromatogram dalam penetapan kadar secara simultan harus lebih besar dari 550 dan resolusi tidak
lebih kecil dari 3,5. Perolehan hasil lempeng teoritas pada tabel 4b diperoleh data bahwa pada perbandingan fase gerak 0,1 asam formiat dalam air - 0,1
asam formiat dalam metanol 30:70 untuk analisa mode polarisasi positif dan perbandingan 70:30 untuk mode polarisasi negatif memberikan memberikan
nilai efisiensi dan pemisahan kolom yang optimal dan memenuhi syarat USP yaitu 11027 untuk amoksisilin; 133882; 1496 untuk ampisilin; 4720 untuk
kloramfenikol. Dari tabel 4.3c dapat dilihat bahwa pada perbandingan fase gerak 0,1
asam formiat dalam air - 0,1 asam formiat dalam metanol 30:70 untuk analisa mode polarisasi positif dan perbandingan 70:30 untuk mode polarisasi
negatif memberikan nilai asimetris yang tidak lebih besar dari 2 sehingga memiliki puncak kromatogram yang ideal dan dengan peningkatan perbandingan
fase gerak 0,1 asam formiat dalam metanol tidak memberikan perubahan nilai tailing factor yang begitu besar.
Dari data pada tabel 4.3, di atas maka dipilihlah kondisi kromatografi dengan perbandingan fase gerak seperti pada tabel 4.4.
Tabel 4.4. Elusi Gradien pada pola ionisasi positif dan negatif.
Waktu menit
Laju Alir mlmin
Pola ionisasi positif Pola ionisasi negatif
0,1 asam formiat
dalam air
0,1 asam formiat dalam
metanol 0,1 asam
formiat dalam air
0,1 asam formiat dalam
metanol
0,0 0,5
98 2
98 2
0,3 0,5
98 2
98 2
7,27 0,5
30 70
70 30
7,37 0,5
1 99
1 99
8,27 0,5
1 99
1 99
13 0,5
98 2
98 2
Universitas Sumatera Utara
4.4 Analisa Kuantitatif
Kategori