UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Larutan dalam microsentrifuge tube yang keluar melewati filter tube kini telah mengandung DNA.
3.4.3 Analisis Hasil Isolasi DNA dengan Spektrofotometer UV untuk DNA
BioDrop, 2015
Instrumen BioDrop DUO yang digunakan dalam analisis ini menggunakan sistem layar sentuh. Setelah dihidupkan dan proses kalibrasi
selesai maka akan tampil 6 menu, pilih “Life Science”, kemudian antara “Nucleic Acid” dan “Protein” pilih “Nucleic Acid”, kemudian “DNA”.
Mode pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA pun berhasil ditampilkan.
Sebelum dilakukan pengukuran, lakukan beberapa penyesuaian antara lain: Pada menu “pathlength” pilih µLite 0.5mm. Untuk mendapatkan
hasil pengukuran dalam nanogram, pada menu “unit” ubah “µgml”
menjadi “ngµl”. Setelah pengaturan selesai, tekan “next” yang
dilambangkan dengan simbol anak panah ke kanan, pengukuran telah dapat dilakukan.
Sebelum mengukur sampel terlebih dahulu dilakukan analisis blangko, blangko dalam hal ini adalah elution buffer. Bersihkan sampel port dengan
tisu, 2 µl elution buffer dimasukkan ke dalam sampel port kemudian pilih “Blangko” dengan simbol kuvet tanpa isi. Setelah itu di layar akan
menampilkan nilai konsentrasi 0,000 ngµl dan pada nama sampel akan tertera reference. Pengukuran sampel dilakukan sama seperti perlakuan
pada blangko, masukan sampel satu persatu dengan sebelumnya tidak lupa selalu membersihkan sampel port dengan tisu sebelum sampel baru
dimasukkan. Selanjutnya pilih “Measure”dengan simbol kuvet berisi pada layar. Akan ditampilkan nilai konsentrasi beserta kemurnian DNA.
3.4.4 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan metode BLAST
menggunakan Database NCBI
Dari laman website NCBI, uji spesifisitas dilakukan dengan terlebih dahulu menuju ke laman BLAST. Pada laman BLAST, klik menu
“Nucleotide Blast”. Setelah itu masukkan urutan basa yang akan diujikan di kolom “Enter Query Sequence”. Pisahkan antar urutan basa dengan
tanda koma ,. Selanjutnya klik BLAST dan tunggu beberapa saat.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Muncul ditampilan berupa data yang berisikan daftar spesies yang memiliki kemiripan dengan data yang diujikan.
3.4.5 Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode
Hydrolysis Probe
Langkah pertama pembuat larutan induk primer dan probe dibuat dengan konsentrasi 100 µM sesuai dengan instruksi yang terdapat dalam
dokumen dari produsen, dari larutan induk tersebut diencerkan konsentrasinya menjadi 10 µM. Pengenceran dibuat sesuai perhitungan
lampiran 4a dengan mencampurkan 10 µl larutan induk dan 90 µl aquadest di dalam microcentifuge tube, kemudian dihomogenkan dengan
menaikturunkan pegas micropipet. Pembuatan master mix disesuaikan protokol yang ada lampiran 4b
mengacu pada penelitian sebelumnya dimana konsentrasi primer ditetapkan sebesar 0,8 µM dan probe 0,2 µM Izzah, 2014. Sebelum
melakukan pencampuran dilakukan perhitungan lampiran 4a, kemudian setiap reaksi master mix dibuat dengan mencampurkan secara berurutan
1,6 µl primer forward, 1,6 µl primer reverse, 1,4 µl aquadest, 0,4 µl probe dan 10 µl probe master. Setelah memasukkan probe dan probe master,
campuran tidak boleh terlalu banyak di homogenkan untuk menghindari kerusakan. Ketika proses pencampuran sampai pada saat pemasukkan ke
dalam instrumen, larutan diwajibkan tidak terpapar cahaya. Penambahan DNA template sebesar 5 µl menjadikan total keseluruhan campuran
menjadi 20 µl. Sebelum running, dilakukan pengaturan subset dan sample editor serta
program amplifikasi dengan LightCycler 480® Software 1,5 seperti pada tabel berikut:
Tabel 4. Program amplifikasi Real-Time PCR Roche
c
, 2008
Setup Detection Format
Block Type Reaction Volume
Mono Color Hydrolysis Probe
96 20 µ L
Programs
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Program Name
Cycles Analysis
Mode
Pre-Incubation 1
None Amplification
40 Quantification
Cooling 1
None
Temperature Targets Target
C Acquistion
Mode Hold
hh:mm:ss Ramp rate
Cs Acquistion
per C
Preincubation
95 None
00:10:00 4,4
-
Amplification
95 None
00:00:15 4,4
- 6061
Single 00:01:00
2,2 -
72 None
00:00:01 4,4
Cooling
40 None
00:00:10 1,5
-
Keterangan: Suhu 61
o
C untuk primer sapi Suhu 60
o
C untuk primer babi Lampiran 6
Setelah campuran master mix dan program amplifikasi siap, terlebih dahulu masukkan 5 µl sampel atau DNA template pada multiwell plate
sesuai dengan pengaturan yang telah dibuat pada subset editor. Kemudian masukkan 15 µl master mix ke setiap sampel secara perlahan dan
dihomogenkan juga dengan sangat perlahan. Kemudian multiwell plate ditutup menggunakan sealing foil yang selanjutnya dirapatkan dan
diratakan menggunakan comb, lalu masukkan pada mesin Real-Time PCR. Instrumen Real-Time PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis
dan langsung memberikan hasil amplifikasi dalam bentuk kurva amplifikasi.
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini menganalisis cemaran daging babi pada produk bakso sapi menggunakan Real-Time PCR dengan metode Hydrolysis Probe. Cemaran daging
babi dapat diketahui melalui amplifikasi DNA ditunjukkan dengan naiknya kurva amplifikasi apabila terjadi kontaminasi daging babi dalam produk bakso sapi yang
diuji.
4.1 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer UV
Berdasarkan hasil analisis, proses ekstraksi dan isolasi DNA menggunakan kit komersial High Pure PCR Template preparation pada penelitian ini
menghasilkan isolat DNA yang cukup baik. Isolat DNA didapatkan dengan menggunakan prinsip memisahkan DNA yang terikat pada filter dari pengotor
lalu mengelusinya, menyesuaikan dengan protokol dan fungsi dari reagen dalam kit tersebut Lampiran 2 3. Lisis sel dilakukan dengan inkubasi
menggunakan Proteinase
K dimana
keberadaan garam
kaotropik menyebabkan inaktifasi seketika semua nuklease. Sentrifugasi membuat
terjadinya ikatan yang selektif antara asam nukleat dengan kapas fiberglas pada filter. Kemudian terjadi ikatan asam nukleat kembali selama proses wash
and spin yang merupakan tahapan pembersihan molekul-molekul kecil. Tahap terakhir digunakan dapar rendah garam untuk melepaskan asam nukleat
yang diperoleh dari kapas fiberglas. Roche
b
, 2012 Isolat DNA yang diperoleh dianalisis dengan Spektrofotometer UV
khusus analisis asam nukleat dengan volume mikro. Dari analisis ini didapat konsentrasi dan kemurnian Isolat DNA. Hasil analisis dapat dilihat pada tabel
berikut:
Tabel 5. Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi
No. Isolat DNA
Konsentrasi ngµl
Kemurnian A260A280
Daging Segar
1. Daging Sapi
77,52 1,913
2. Daging Babi
80,08 1,824
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Nilai konsentrasi dan kemurnian DNA diperoleh melalui pengukuran menggunakan Spektrofotometer UV khusus analisis volume mikro dengan
limit deteksi 1 ngµl dan akurasi panjang gelombang
±
2 nm. BioDrop, 2015. Analisis dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Dari
perbandingan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm di dapat rasio angka yang mencerminkan tingkat kemurnian DNA terhadap protein.
Konsentrasi DNA pada Daging Sapi DS adalah 77,52 ngµl dan Daging Babi DB sebesar 80,08 ngµl. Konsentrasi ini mendekati dengan target
konsentrasi percobaan yang diharapkan menggunakan kit High Pure PCR Template Preparation yakni dapat mengisolasi DNA dari sampel berupa
jaringan sebanyak 20 µg200 µl atau setara dengan 100 ngµl Roche
b
, 2012. Hasil Isolat bakso baik simulasi maupun sampel diperoleh konsentrasi yang
lebih rendah. Konsentrasi Simulasi Bakso Sapi SS; Simulasi Bakso Babi SB; Bakso AA; Bakso FF; Bakso GG; Bakso II; Bakso KiKI; Bakso
KoKO; Bakso Mr.B Mr.B dan Bakso SR SR yang didapatkan dalam ngµl berturut-turut adalah 15,52; 38,06; 35,95; 56,15; 33,65; 33,81; 36,70; 18,12;
32,04; dan 46,06. Nilai konsentrasi DNA pada olahan daging bakso berkisar antara 15-50 ngµl, nilai tersebut kurang dari setengah dibandingkan
Simulasi Bakso
3. Simulasi Bakso Sapi
15,52 1,638
4. Simulasi Bakso Babi
38,06 1,897
Sampel Bakso
5. Bakso A
35,95 1,716
6. Bakso F
56,15 1,747
7. Bakso G
33,65 1,629
8. Bakso I
33,81 1,707
9. Bakso Ki
36,70 1,773
10. Bakso Ko
18,12 1,629
11. Bakso Mr.B
32,04 1,880
12. Bakso SR
46,06 1,642
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
konsentrasi pada daging segar. Konsentrasi yang diperoleh dari semua sampel memenuhi syarat untuk diujikan menggunakan Real-Time PCR.
Kemurnian dari Isolat DNA yang diperoleh akan mempengaruhi akurasi percobaan. Sampel dengan tingkat kemurnian rendah tidak murni
menunjukkan adanya kontaminasi yang akan menyebabkan hasil amplifikasi tidak spesifik. Kontaminasi dengan protein yang terjadi pada isolat DNA
dikarenakan proses ekstraksi yang kurang sempurna. DNA dikatakan murni dari campuran protein apabila nilai perbandingan A260A280 berkisar antara
1,8 sampai 2,0 Sambrook et al., 1989. Kemurnian atau nilai perbandingan A260A280 pada sampel daging sapi
dan daging babi masing-masing 1,913 dan 1,824. Angka tersebut telah masuk dalam kisaran kemurnian yang baik. Berbeda dengan daging segar, hasil yang
bervariasi ditunjukkan pada sampel bakso. Angka kemurnian Simulasi Bakso Sapi; Simulasi Bakso Babi; Bakso A; Bakso F; Bakso G; Bakso I; Bakso Ki;
Bakso Ko; Bakso Mr.B dan Bakso SR masing-masing adalah 1,638; 1,897; 1,716; 1,747; 1,629; 1,707; 1,773; 1,629; 1,880 dan 1,642. Hanya Simulasi
Bakso Babi dan Bakso Mr.B saja yang tergolong memiliki kemurnian ideal yakni dengan angka 1,897 dan 1,880. Sisanya mendapat angka tidak terpaut
jauh dibawah 1,8. Rasio ~ 1,8 umumnya dapat diterima untuk DNA dikatakan murni NanoDrop, 2007.
Konsentrasi dan kemurnian Isolat DNA merupakan faktor penting dalam analisis DNA. Konsentrasi yang baik tanpa di iringi kemurnian yang baik pula
sangat memungkinkan terjadinya kesalahan analisis disebabkan DNA yang tidak spesifik. Sebaliknya, kemurnian yang baik namun tidak dibarengi pula
dengan konsentrasi yang baik menyebabkan tidak teramplifikasinya DNA sampel jika konsentarsinya rendah atau justru menghasilkan amplifikasi yang
berlebihan jika konsentrasinya tinggi sehingga berakibat terjadinya kesulitan dalam menganalisis sampel yang di uji karena kurva amplifikasinya terlalu
cepat mencapai fase plateau.
4.2 Hasil Analisis Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI
Analisis primer dan probe dilakukan secara in silico dengan menggunakan program BLAST yang di akses dari laman NCBI. Tujuan analisis ini untuk
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
mengetahui tingkat spesifisitas primer dan probe yang digunakan apakah hanya mengamplifikasi satu jenis spesies saja.
Uji spesifisitas primer dilakukan dengan memasukan urutan basa dari primer forward, probe dan pasangan dari primer reverse untuk kemudian di
cari kemiripannya dengan urutan basa yang ada dalam database NCBI. Pengunjung dapat memilih sumber database sebagai acuan pencarian, dalam
hal ini database yang digunakan adalah nucleotida collection nrnt. Dari pencarian tersebut ditampilkan spesies-spesies yang memiliki kemiripan
urutan basanya dengan urutan basa dari data yang dimasukkan, maka didapatlah spesies yang paling identik. NCBI, 2015
Gambar 4.1 Hasil Uji spesifisitas primer dan probe sapi dengan program
BLAST pada laman NCBI
Keterangan: = primer forward ;
= probe = RT primer reverse
Uji spesifisitas primer sapi digunakan DNA target dengan panjang amplifikasi 120 pasang basa yang diperoleh dari area sitokrom b mitokondria
susunan basa dna pada sapi. Hasil dari uji spesifisitas ini didapatkan kesesuaian hasil dengan yang diharapkan. Diperoleh kesesuaian dengan DNA
mitokondria spesies Bos taurus yang merupakan spesies sapi yang banyak beredar di Indonesia. Hanya spesies tersebut yang memiliki urutan basa
identik 100 dengan urutan basa dari primer dan probe yang digunakan. Hal ini menunjukkan bahwa primer forward, probe dan primer reverse yang
digunakan spesifik dengan DNA sapi.
