UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
mengamplifikasi DNA khususnya menggunakan primer sapi dan babi menggunakan susunan basa dari Tanabe et al. Selain membutuhkan
kecermatan dan ketelitian dalam pengerjaan, yang tak kalah penting dalam amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan Metode Hydrolysis
probe adalah ketepatan dalam penentuan konsentrasi larutan master mix dan penentuan suhu dalam proses PCR. Setelah didapatkan pasangan primer dan
probe yang spesifik dan ditetapkan konsentrasi larutan serta suhu amplifikasi, perlu di lakukan proses optimasi demi mendapatkan hasil yang optimal.
Konsentrasi probe yang digunakan dalam penelitian ini adalah 0,2 M, merupakan batas atas dari konsentrasi yang direkomendasikan yakni 0,05-0,2
M. Sedangkan konsentrasi primer yang digunakan ditetapkan 0,8 M, dipilih berdasarkan acuan rekomendasi yakni 0,5-1 M. Roche
c
, 2008. Suhu Amplifikasi disesuaikan berdasarkan perkiraan dari suhu Tm lampiran 5 dan
dikombinasikan dengan hasil optimasi menggunakan PCR gradien oleh Rahmawati 2012 sehingga ditetapkan suhu annealing yang digunakan
adalah 61
o
C untuk sampel dengan primer sapi dan 60
o
C untuk sampel dengan primer babi selama 1 menit. Sedangkan untuk suhu denaturasi dan ekstensi
disesuaikan sebagaimana protokol yakni 95
o
C selama 15 detik dan 72
o
C selama 1 detik.
4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode
Hydrolysis Probe menggunakan Primer Sapi Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode
Hydrolysis Probe memiliki keunggulan dibandingkan dengan metode SyBr Green. Metode Hydrolysis probe terbukti lebih spesifik mengamplifikasi
sampel yang diujikan Izzah, 2014. Pada penelitian ini hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR digunakan sebagai dasar utama
identifikasi cemaran daging babi pada sampel bakso sapi yang di ujikan. Hasil Amplifikasi DNA juga dapat dianalisis untuk mendeteksi keberadaan
bahan baku daging sapi yang digunakan pada pembuatan bakso.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4.3 Kurva Amplifikasi Real-Time PCR menggunakan Primer Sapi
Keterangan: DS = Daging Sapi; SS = Simulasi Bakso Sapi; NTC = No Template Control; SB = Simulasi Bakso Babi; DB = Daging Babi
Dalam analisis menggunakan Real-Time PCR, kenaikan kurva amplifikasi menandakan kenaikan konsentrasi DNA yang berpasangan dengan primer dan
probe yang di ujikan. Kenaikan kurva dikarenakan peningkatan fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan double stranded DNA. Fluoresensi yang
dihasilkan sebanding dengan jumlah DNA template yang teramplifikasi Dooley et al., 2004. Hasil amplifikasi menunjukan setidaknya terdapat 3
kelompok sampel berdasarkan kurva yang terbentuk. Kelompok pertama terdiri dari DS; F; I ; Mr.B; KO; A; SR terlihat memiliki ujung kurva amplifikasi yang
tertinggi. Kelompok kedua adalah SS dan KI membentuk kurva aplikasi yang memiliki kenaikan namun landai dengan ujung kurva amplifikasi yang nyaris
berhimpit. Kelompok ketiga dan yang terakhir yakni G, NTC, DB, SB berurutan dari yang memiliki amplifikasi tertinggi nampak sangat sedikit
mengalami kenaikan bahkan justru terkesan tidak naik. Kelompok pertama adalah sampel yang memiliki kurva paling sesuai
dengan fase dalam PCR. Hasil peningkatan fluorescent sejatinya digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fase yaitu fase awal, fase
A
I
KO
Mb DS
F
SR SS
KI
G,NTC, DB,SB
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
eksponensial atau puncak dan fase plateau atau stabil Vaerman, 2004. Kelompok ini secara meyakinkan terbukti mengandung DNA Sapi didalamnya.
Kelompok kedua terdiri dari dua sampel yang memiliki kurva landai atau terlalu cepat memasuki fase puncak atau fase stabil. Kondisi ini biasanya
terjadi akibat terlalu pekatnya konsentrasi DNA. Kemungkinan lain adalah telah sampai kepada kemampuan puncaknya reagen PCR dalam
mengamplifikasi DNA yang diakibatkan kehabisan dNTP atau komponen reagen lainnya. Untuk Kelompok ini masih dapat dibuktikan bahwasanya
sampel mengandung DNA sapi didalamnya. Kelompok ketiga terdapat 4 sampel yang terdiri dari 3 sampel yang
memang diprediksi tidak akan mengalami amplifikasi dan 1 sampel yang diduga terdapat banyak pengotor didalamnya. Dari kurva amplifikasi yang
terbentuk dapat diinterpretasikan bahwasanya sampel tersebut tidak mengandung DNA target. Hasil amplifikasi sampel menggunakan primer sapi
ini digunakan sebagai pelengkap, ditujukan untuk mengetahui keberadaan daging sapi yang merupakan bahan baku sampel.
4.3.2.1 Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Second Derivative
Maximum
Instrumen LightCycler 480 Real-Time PCR yang digunakan dalam penelitian ini menyediakan dua jenis metode analisis penentuan Crossing Point
CP bagi penggunanya, yakni Metode Second Derivative Maximum dan Fit Point. CP adalah titik dimana fluorescent dari sampel naik melewati
fluorescent background atau base line. Siklus dimana kurva setiap sampel naik melewati background tergantung jumlah target DNA yang terdapat pada awal
sebelum proses amplifikasi Roche
b
, 2012. Dalam analisis kualitatif keberadaan CP menunjukkan keberadaan DNA target dalam sampel yang
diujikan. Metode Analisis Second Derivative Maximum dalam mengidentifikasi
nilai CP menggunakan titik dimana kurva amplifikasi dari sampel mengalami kenaikan yang tajam. Titik ini disesuaikan dengan angka maksimum turunan
kedua berdasarkan atas fakta bahwasanya peningkatan fluorescent terjadi secara eksponen. Dalam penentuannya software instrumen ini melakukkan
perhitungan hal tetrsebut secara otomatis. Roche
b
, 2012