Hasil Analisis Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta mengamplifikasi DNA khususnya menggunakan primer sapi dan babi menggunakan susunan basa dari Tanabe et al. Selain membutuhkan kecermatan dan ketelitian dalam pengerjaan, yang tak kalah penting dalam amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan Metode Hydrolysis probe adalah ketepatan dalam penentuan konsentrasi larutan master mix dan penentuan suhu dalam proses PCR. Setelah didapatkan pasangan primer dan probe yang spesifik dan ditetapkan konsentrasi larutan serta suhu amplifikasi, perlu di lakukan proses optimasi demi mendapatkan hasil yang optimal. Konsentrasi probe yang digunakan dalam penelitian ini adalah 0,2 M, merupakan batas atas dari konsentrasi yang direkomendasikan yakni 0,05-0,2 M. Sedangkan konsentrasi primer yang digunakan ditetapkan 0,8 M, dipilih berdasarkan acuan rekomendasi yakni 0,5-1 M. Roche c , 2008. Suhu Amplifikasi disesuaikan berdasarkan perkiraan dari suhu Tm lampiran 5 dan dikombinasikan dengan hasil optimasi menggunakan PCR gradien oleh Rahmawati 2012 sehingga ditetapkan suhu annealing yang digunakan adalah 61 o C untuk sampel dengan primer sapi dan 60 o C untuk sampel dengan primer babi selama 1 menit. Sedangkan untuk suhu denaturasi dan ekstensi disesuaikan sebagaimana protokol yakni 95 o C selama 15 detik dan 72 o C selama 1 detik.

4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode

Hydrolysis Probe menggunakan Primer Sapi Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode Hydrolysis Probe memiliki keunggulan dibandingkan dengan metode SyBr Green. Metode Hydrolysis probe terbukti lebih spesifik mengamplifikasi sampel yang diujikan Izzah, 2014. Pada penelitian ini hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR digunakan sebagai dasar utama identifikasi cemaran daging babi pada sampel bakso sapi yang di ujikan. Hasil Amplifikasi DNA juga dapat dianalisis untuk mendeteksi keberadaan bahan baku daging sapi yang digunakan pada pembuatan bakso. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 4.3 Kurva Amplifikasi Real-Time PCR menggunakan Primer Sapi Keterangan: DS = Daging Sapi; SS = Simulasi Bakso Sapi; NTC = No Template Control; SB = Simulasi Bakso Babi; DB = Daging Babi Dalam analisis menggunakan Real-Time PCR, kenaikan kurva amplifikasi menandakan kenaikan konsentrasi DNA yang berpasangan dengan primer dan probe yang di ujikan. Kenaikan kurva dikarenakan peningkatan fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan double stranded DNA. Fluoresensi yang dihasilkan sebanding dengan jumlah DNA template yang teramplifikasi Dooley et al., 2004. Hasil amplifikasi menunjukan setidaknya terdapat 3 kelompok sampel berdasarkan kurva yang terbentuk. Kelompok pertama terdiri dari DS; F; I ; Mr.B; KO; A; SR terlihat memiliki ujung kurva amplifikasi yang tertinggi. Kelompok kedua adalah SS dan KI membentuk kurva aplikasi yang memiliki kenaikan namun landai dengan ujung kurva amplifikasi yang nyaris berhimpit. Kelompok ketiga dan yang terakhir yakni G, NTC, DB, SB berurutan dari yang memiliki amplifikasi tertinggi nampak sangat sedikit mengalami kenaikan bahkan justru terkesan tidak naik. Kelompok pertama adalah sampel yang memiliki kurva paling sesuai dengan fase dalam PCR. Hasil peningkatan fluorescent sejatinya digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fase yaitu fase awal, fase A I KO Mb DS F SR SS KI G,NTC, DB,SB UIN Syarif Hidayatullah Jakarta eksponensial atau puncak dan fase plateau atau stabil Vaerman, 2004. Kelompok ini secara meyakinkan terbukti mengandung DNA Sapi didalamnya. Kelompok kedua terdiri dari dua sampel yang memiliki kurva landai atau terlalu cepat memasuki fase puncak atau fase stabil. Kondisi ini biasanya terjadi akibat terlalu pekatnya konsentrasi DNA. Kemungkinan lain adalah telah sampai kepada kemampuan puncaknya reagen PCR dalam mengamplifikasi DNA yang diakibatkan kehabisan dNTP atau komponen reagen lainnya. Untuk Kelompok ini masih dapat dibuktikan bahwasanya sampel mengandung DNA sapi didalamnya. Kelompok ketiga terdapat 4 sampel yang terdiri dari 3 sampel yang memang diprediksi tidak akan mengalami amplifikasi dan 1 sampel yang diduga terdapat banyak pengotor didalamnya. Dari kurva amplifikasi yang terbentuk dapat diinterpretasikan bahwasanya sampel tersebut tidak mengandung DNA target. Hasil amplifikasi sampel menggunakan primer sapi ini digunakan sebagai pelengkap, ditujukan untuk mengetahui keberadaan daging sapi yang merupakan bahan baku sampel.

4.3.2.1 Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Second Derivative

Maximum Instrumen LightCycler 480 Real-Time PCR yang digunakan dalam penelitian ini menyediakan dua jenis metode analisis penentuan Crossing Point CP bagi penggunanya, yakni Metode Second Derivative Maximum dan Fit Point. CP adalah titik dimana fluorescent dari sampel naik melewati fluorescent background atau base line. Siklus dimana kurva setiap sampel naik melewati background tergantung jumlah target DNA yang terdapat pada awal sebelum proses amplifikasi Roche b , 2012. Dalam analisis kualitatif keberadaan CP menunjukkan keberadaan DNA target dalam sampel yang diujikan. Metode Analisis Second Derivative Maximum dalam mengidentifikasi nilai CP menggunakan titik dimana kurva amplifikasi dari sampel mengalami kenaikan yang tajam. Titik ini disesuaikan dengan angka maksimum turunan kedua berdasarkan atas fakta bahwasanya peningkatan fluorescent terjadi secara eksponen. Dalam penentuannya software instrumen ini melakukkan perhitungan hal tetrsebut secara otomatis. Roche b , 2012

Dokumen yang terkait

Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

1 64 90

Analisis Cemaran Daging Babi Pada Kornet Sapi di Wilayah Ciputat dengan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)

3 16 72

Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

1 9 66

Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk Analisis Kehalalan

1 11 70

Perbandingan antara metode SYBR green dan metode hydrolysis probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan menggunakan real time PCR

1 33 90

Analisis Kandungan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi pada Cangkang Kapsul Keras yang Mengandung Vitamin A Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction

0 13 80

DETEKSI DAGING BABI PADA PRODUK BAKSO YANG DIJAJAKAN DI PUSAT KOTA SALATIGA MENGGUNAKAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR).

0 1 2

IDENTIFIKASI DAGING BABI PADA BAKSO YANG BEREDAR DI PASAR WAGE PURWOKERTO MENGGUNAKAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) DAN ANALISIS RESTRIKSI MENGGUNAKAN ENZIM BamH1 DAN BseD1 SKRIPSI

0 0 14

IDENTIFIKASI KANDUNGAN DAGING BABI PADA DENDENG SAPI YANG BEREDAR DI SWALAYAN PURWOKERTO MENGGUNAKAN METODE REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) - repository perpustakaan

0 0 15

HALAMAN PERSETUJUAN IDENTIFIKASI DAGING BABI DALAM DAGING KEBAB YANG BEREDAR DI PURWOKERTO MENGGUNAKAN METODE REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) KHOTIMAH

0 0 17