UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Larutan yang terbentuk ditambah dengan 200 µl Binding Buffer, vortex hingga homogen dan inkubasi kembali pada suhu 70
o
C selama 10 menit. Lanjutkan dengan penambahan isopropanol 100 µl, vortex hingga
homogen. Untuk menghilangkan partikel-partikel tidak larut bisa dilakukan dengan mempipet larutan dengan micro pipet 1ml. Ketika cairan
dikeluarkan maka partikel-partikel tidak larut akan tertinggal di tips. Masukkan cairan yang telah bebas dari partikel tidak larut ke dalam
filter tube yang telah dipasangkan dengan collection tube. Sentrifugasi menggunakan refrigerated centrifuge selama 1 menit dengan putaran 8700
rpm. DNA akan tertinggal pada kapas fiberglas di filter tube. Siap untuk proses pemurnian dan elusi.
3.4.2.3 Proses Pemurnian dan Elusi DNA Roche
b
,2012
Buang collection tube beserta cairan yang tertampung didalamnya. Filter tube yang mengandung DNA dipasangkan kembali dengan
collection tube baru, kemudian tambahkan 500 µl inhibitor removal buffer ke dalam filter tube. Sentrifugasi kembali dengan putaran 8700 rpm
selama 1 menit. Lepaskan filter tube dan kembali pasangkan dengan collection tube
baru. Buang collection tube beserta cairan yang ditampungnya. Tambahkan 500 µl wash buffer ke dalam filter tube, lakukan sentrifugasi
dengan putaran 8700 rpm selama 1 menit. Proses sebelumnya diulangi untuk benar-benar didapatkan DNA yang
murni. Lepaskan filter tube dan kembali pasangkan dengan collection tube baru. Buang collection tube beserta cairan yang ditampungnya.
Tambahkan 500 µl wash buffer ke dalam filter tube, lakukan sentrifugasi dengan putaran 8700 rpm selama 1 menit kembali. Tahap akhir pemurnian
setelah cairan di dalam collection tube dibuang, pasangkan kembali filter tube dan collection tube tersebut. Kemudian sentrifugasi dengan kecepatan
maksimum yakni 15000 rpm selama 10 detik. Untuk mengelusi DNA, pasangkan filter tube dengan microsentrifuge
tube baru yang bersih dan steril. Tambahkan 200 µl elution buffer yang sebelumnya telah dihangatkan pada suhu 70
o
C. Sentrifugasi dengan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Larutan dalam microsentrifuge tube yang keluar melewati filter tube kini telah mengandung DNA.
3.4.3 Analisis Hasil Isolasi DNA dengan Spektrofotometer UV untuk DNA
BioDrop, 2015
Instrumen BioDrop DUO yang digunakan dalam analisis ini menggunakan sistem layar sentuh. Setelah dihidupkan dan proses kalibrasi
selesai maka akan tampil 6 menu, pilih “Life Science”, kemudian antara “Nucleic Acid” dan “Protein” pilih “Nucleic Acid”, kemudian “DNA”.
Mode pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA pun berhasil ditampilkan.
Sebelum dilakukan pengukuran, lakukan beberapa penyesuaian antara lain: Pada menu “pathlength” pilih µLite 0.5mm. Untuk mendapatkan
hasil pengukuran dalam nanogram, pada menu “unit” ubah “µgml”
menjadi “ngµl”. Setelah pengaturan selesai, tekan “next” yang
dilambangkan dengan simbol anak panah ke kanan, pengukuran telah dapat dilakukan.
Sebelum mengukur sampel terlebih dahulu dilakukan analisis blangko, blangko dalam hal ini adalah elution buffer. Bersihkan sampel port dengan
tisu, 2 µl elution buffer dimasukkan ke dalam sampel port kemudian pilih “Blangko” dengan simbol kuvet tanpa isi. Setelah itu di layar akan
menampilkan nilai konsentrasi 0,000 ngµl dan pada nama sampel akan tertera reference. Pengukuran sampel dilakukan sama seperti perlakuan
pada blangko, masukan sampel satu persatu dengan sebelumnya tidak lupa selalu membersihkan sampel port dengan tisu sebelum sampel baru
dimasukkan. Selanjutnya pilih “Measure”dengan simbol kuvet berisi pada layar. Akan ditampilkan nilai konsentrasi beserta kemurnian DNA.
3.4.4 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan metode BLAST
menggunakan Database NCBI
Dari laman website NCBI, uji spesifisitas dilakukan dengan terlebih dahulu menuju ke laman BLAST. Pada laman BLAST, klik menu
“Nucleotide Blast”. Setelah itu masukkan urutan basa yang akan diujikan di kolom “Enter Query Sequence”. Pisahkan antar urutan basa dengan
tanda koma ,. Selanjutnya klik BLAST dan tunggu beberapa saat.
