Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer UV

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta mengetahui tingkat spesifisitas primer dan probe yang digunakan apakah hanya mengamplifikasi satu jenis spesies saja. Uji spesifisitas primer dilakukan dengan memasukan urutan basa dari primer forward, probe dan pasangan dari primer reverse untuk kemudian di cari kemiripannya dengan urutan basa yang ada dalam database NCBI. Pengunjung dapat memilih sumber database sebagai acuan pencarian, dalam hal ini database yang digunakan adalah nucleotida collection nrnt. Dari pencarian tersebut ditampilkan spesies-spesies yang memiliki kemiripan urutan basanya dengan urutan basa dari data yang dimasukkan, maka didapatlah spesies yang paling identik. NCBI, 2015 Gambar 4.1 Hasil Uji spesifisitas primer dan probe sapi dengan program BLAST pada laman NCBI Keterangan: = primer forward ; = probe = RT primer reverse Uji spesifisitas primer sapi digunakan DNA target dengan panjang amplifikasi 120 pasang basa yang diperoleh dari area sitokrom b mitokondria susunan basa dna pada sapi. Hasil dari uji spesifisitas ini didapatkan kesesuaian hasil dengan yang diharapkan. Diperoleh kesesuaian dengan DNA mitokondria spesies Bos taurus yang merupakan spesies sapi yang banyak beredar di Indonesia. Hanya spesies tersebut yang memiliki urutan basa identik 100 dengan urutan basa dari primer dan probe yang digunakan. Hal ini menunjukkan bahwa primer forward, probe dan primer reverse yang digunakan spesifik dengan DNA sapi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 4.2 Hasil Uji spesifisitas primer dan probe babi dengan program BLAST pada laman NCBI Keterangan: = primer forward ; = probe = RT primer reverse Uji spesifisitas primer babi digunakan DNA target dengan panjang amplifikasi 131 pasang basa . Hasil dari uji spesifisitas ini didapatkan spesies Sus scrofa yang merupakan spesies babi yang banyak beredar di Indonesia. Spesies tersebut memiliki urutan basa identik 100 dengan urutan basa dari primer dan probe yang digunakan. Selain Sus scrofa, terdapat dua spesies lagi yang memiliki identitas 100 dengan urutan basa dari primer dan probe yang digunakan. Perbedaan walau hanya 1 pasang basa saja masih memungkinkan menyebabkan terjadinya kesalahan analisis. Spesies tersebut adalah Atherurus africanus sejenis landak yang terdapat di benua Afrika dan Phlebotomus perniciosus yakni nyamuk yang terdapat di benua Eropa. Berdasarkan perbedaan spesies dan lokasi penyebaran yang cukup signifikan, pasangan primer dan probe ini masih relevan digunakan untuk identifikasi babi di Indonesia. Primer forward, probe dan primer reverse yang digunakan spesifik dengan DNA dari spesies babi yang beredar di Indonesia yakni Sus scrofa.

4.3 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR

4.3.1 Penetapan Metode Amplifikasi Yang Optimal

Amplifikasi menggunakan Real-Time PCR dilakukan mengacu kepada metode yang pernah dilakukan oleh Izzah 2014 yang merupakan modifikasi dari Rahmawati 2012. Metode tersebut dianggap cukup optimal dalam UIN Syarif Hidayatullah Jakarta mengamplifikasi DNA khususnya menggunakan primer sapi dan babi menggunakan susunan basa dari Tanabe et al. Selain membutuhkan kecermatan dan ketelitian dalam pengerjaan, yang tak kalah penting dalam amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan Metode Hydrolysis probe adalah ketepatan dalam penentuan konsentrasi larutan master mix dan penentuan suhu dalam proses PCR. Setelah didapatkan pasangan primer dan probe yang spesifik dan ditetapkan konsentrasi larutan serta suhu amplifikasi, perlu di lakukan proses optimasi demi mendapatkan hasil yang optimal. Konsentrasi probe yang digunakan dalam penelitian ini adalah 0,2 M, merupakan batas atas dari konsentrasi yang direkomendasikan yakni 0,05-0,2 M. Sedangkan konsentrasi primer yang digunakan ditetapkan 0,8 M, dipilih berdasarkan acuan rekomendasi yakni 0,5-1 M. Roche c , 2008. Suhu Amplifikasi disesuaikan berdasarkan perkiraan dari suhu Tm lampiran 5 dan dikombinasikan dengan hasil optimasi menggunakan PCR gradien oleh Rahmawati 2012 sehingga ditetapkan suhu annealing yang digunakan adalah 61 o C untuk sampel dengan primer sapi dan 60 o C untuk sampel dengan primer babi selama 1 menit. Sedangkan untuk suhu denaturasi dan ekstensi disesuaikan sebagaimana protokol yakni 95 o C selama 15 detik dan 72 o C selama 1 detik.

4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode

Hydrolysis Probe menggunakan Primer Sapi Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode Hydrolysis Probe memiliki keunggulan dibandingkan dengan metode SyBr Green. Metode Hydrolysis probe terbukti lebih spesifik mengamplifikasi sampel yang diujikan Izzah, 2014. Pada penelitian ini hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR digunakan sebagai dasar utama identifikasi cemaran daging babi pada sampel bakso sapi yang di ujikan. Hasil Amplifikasi DNA juga dapat dianalisis untuk mendeteksi keberadaan bahan baku daging sapi yang digunakan pada pembuatan bakso.