Asam Nukleat dan Protein DNA

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pasangan G dan C terbentuk dengan tiga ikatan. Oleh karena itu, pasangan G dan C lebih stabil daripada pasanagan A dan T Muladno, 2010. Gambar 2.5 . Struktur double helix DNA Sumber: Brooks, 2003 DNA Deoxyribonucleic Acid merupakan polimer linear yang tersusun dari unit –unit nukleotida yang mengkode materi genetik yang dapat diwariskan. Pengaturan urutan dan banyaknya basa-basa nukleotida inilah yang membawa informasi genetik dalam sel. Setiap jenis mikroorganisme mempunyai urutan dan jumlah basa nukleotida yang dapat sangat berbeda, tetapi setiap jenis mikroorganisme akan menurunkan generasinya dengan urutan dan banyaknya basa-basa nukleotida yang sama. Sintesis DNA akan diteruskan ke sel keturunan menyediakan mekanisme untuk pembuatan salinan yang tepat melalui penggunaan basa komplementer Purnomo, 2004. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 2.6 Susunan dan Replikasi DNA Sumber: Purnomo, 2004 Apabila benang I b1 direplikasi, maka dihasilkan benang tunggal b2a yang identik dengan benang II b2, dan sebaliknya apabila benang II b2 direplikasi maka akan dihasilkan benang tunggal b1a yang identik benang I b1. Hasil akhir merupakan dua benang heliks yang masing-masing mengandung satu benang pencetak asli dan satu benang baru. Arah replikasi DNA hanya paada C5 ke C3 sehingga hanya satu benang yang dapat direplikasi secara utuh dan benang antiparalelnya direplikasi sepotong- sepotong kemudian disambung oleh ensim DNA-ligase. Purnomo, 2004 Sifat Fisika DNA adalah DNA akan terpisah dari rantai komplemennya denaturasi pada suhu mendekati titik didih dan pH ekstrim pH 3 atau pH 10 dan bisa bergabung kembali renaturasi pada suhu ± 60 C Watson et al,1988. DNA menyerap sinar UV dengan panjang gelombang 260 nm Sambrook et al, 1989.

2.5.2 DNA Mitokondria

Mitokondria merupakan organel sel yang berfungsi sebagai penghasil energi. Fungsi penting mitokondria adalah menerima substrat untuk metabolisme energi asam lemak, piruvat, kerangka karbon dan asam amino dari sitoplasma dan menghancurkan secara oksidatif bahan-bahan tersebut menjadi CO 2 dan H 2 O dan menghasilkan adenosin trifosfat ATP. Dengan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta demikian mitokondria disebut ”pembangkit tenaga” bagi sel Koolman et al, 2005. Keseluruhan mitokondria dalam satu sel mencapai hingga 25 volume sel. Mitokondria dikelilingi oleh dua membran yaitu membran dalam dan membran luar. Ruang antara membran dalam dan luar disebut ruang antar membran. Membran bagian dalam membentuk lipatan-lipatan yang disebut kristae dimana terdapat enzim-enzim oksidase Membran dalam juga memiliki permukaan yang besar yang mengelilingi ruang matriks. Matriks ini mengandung DNA, RNA, ribosom dan berbagai enzim yang berperan dalam oksidasi zat-zat makanan. Koolman et al, 1994. Mitokondria memiliki perangkat genetik sendiri yaitu DNA mitokondria atau sering disingkat mtDNA. Dengan bantuan DNAnya, mitokondria mempunyai kemampuan untuk mensintesis sendiri beberapa proteinnya. Namun bagian terbesar protein mitokondria disandi di dalam inti sel, kemudian disintesis pada ribosom yang bebas dalam sitoplasma dan diimpor ke dalam mitokondria Koolman et al, 1994. Ukuran genom mitokondria minimum untuk berfungsinya mitokondria hewan multiseluler adalah 14.000 pasang basa dari total ukuran yang berkisar hingga 39.000 pasang basa. DNA mitokondria merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler. Ukuran DNA mitokondria relatif sangat kecil dibandingkan dengan ukuran genom intinya. Solihin, 1994. DNA mitokondria hewan secara umum memiliki jumlah dan jenis gen yang sama yaitu 13 daerah yang mengkode protein URF1, URF2, URF3, URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrome Oxidase unit I, Cytochrome Oxidase unit II, Cytochrome Oxidase unit III, Cytochrome b dan ATPase 6; 2 gen pengkode rRNA yaitu 12S rRNA dan 16S rRNA; 22 gen pengkode tRNA Solihin, 1994. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 2.7 . Struktur mtDNA pada manusia Sumber: Passarge, 2007 DNA mitokondria bersifat khusus yang diturunkan melalui induk betina tanpa mengalami rekombinasi. Adanya sifat tersebut dapat digunakan untuk suatu rekonstitusi historik dari genealogi matrilinier suatu spesies maupun antar populasi yang ada. Beberapa hal yang mendukung penggunaan mtDNA sebagai penanda dalam studi keragaman genetik dan studi biologi populasi pada hewan yaitu Solihin, 1994: 1. DNA mitokondria terdapat dalam jumlah kopi yang tinggi. Jumlah kopi yang tinggi ini menjadikannya mudah diisolasi dan dipurifikasi untuk berbagai keperluan analisis genom. 2. Ukuran DNA mitokondria relatif kecil 14-39 kb sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh. 3. Bagian-bagian dari genom mitokondria berevolusi dengan kecepatan yang berbeda. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4. DNA mitokondria hewan tidak memiliki intron ataupun spacer yang berukuran besar antar gennya. 5. DNA mitokondria bersifat khusus karena diturunkan melalui induk betinanya tanpa mengalami rekombinasi strict matertralinheritance. 6. DNA mitokondria sangat polimorf, baik untuk intrapopulasi maupun untuk interspesies.

2.5.3 Isolasi DNA

Semua organisme disusun oleh sel yang mengandung elemen genetik yang sama yaitu DNA yang terdapat dalam kromosom. Kromosom eukariot berbentuk linier sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom Gaffar, 2007. Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lain. Isolasi DNA dari organisme eukariot dilakukan melalui proses penghancuran membran sel lisis, pemusnahan protein dan RNA, dan pemanenan DNA Muladno, 2010. Membran sel dilisis dengan menambahkan buffer yang mengandung satu atau lebih deterjen, contohnya SDS B, NP-40, atau Triton X-100 untuk membebaskan isinya. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat pengrusakan oleh detergen tersebut dibersihkan dengan cara sentrifugasi Kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protenase yang berfungsi untuk mendegragasi protein dan RNAse yang berfungsi untuk mendegragasi RNA, sehingga tertinggal hanyalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 C untuk menginaktivasi enzim yang mendegradasi DNA DNAse. Larutan DNA kemudian dipresipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air Gaffar, 2007. Namun, isolasi DNA kini lebih mudah dengan bantuan teknologi canggih yang menghasilkan isolat DNA dengan kemurnian tinggi, hasil yang cepat, dan penggunaan yang mudah Saiyed, 2007. Saat ini banyak sekali produsen yang menyediakan berbagai kit isolasi DNA. Kit yang disediakan dapat dengan cepat dan mudah mengisolasi DNA genom dari beragam jenis sampel UIN Syarif Hidayatullah Jakarta termasuk darah, daging, kultur sel, sampel klinis sputum, feses, jaringan hewan, ekor tikus, ragi dan banyak lagi Roche d ,2012

2.6 Polymerase Chain Reaction PCR

Reaksi berantai polymerase Polymerase Chain Reaction, PCR adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. Yusuf, 2010. DNA polymerase ini biasanya disintesis dari mikroorganisme yang hidup pada suhu panas, seperti Thermophilus aquaticus, sehingga enzim yang berasal dari mikroorganisme tersebut disebut Taq polymerase Passarge, 2007. Dengan teknik ini sejumlah fragmen kecil DNA yang diinginkan akan diamplifikasi secara eksponensial sampai jutaan kali dalam beberapa jam Sulistyaningsih, 2007. PCR digunakan untuk menggadakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycle Muladno, 2010. Amplifikas DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang disebut amplimers. Primer DNA adalah suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA Yusuf, 2010. PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA Primer yang berada sebelum daerah target disebut primer forward dan yang berada setelah daerah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA yang baru dikenal disebut enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP nukleotida berbasa Adenin, dCTP sitosin, dGTP guanin, dan dTTP Timin Muladno, 2010. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 2.8 Simulasi Proses PCR Sumber: Yusuf, 2010

2.6.1 Komponen PCR

Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR adalah template DNA, sepasang primer oligonukleotida, DNA polymerase, deoksinukleosida trifosfat dNTP, dan larutan buffer Yusuf, 2010; Muladno, 2010; Gaffar, 2007; Sulistyaningsih, 2007: 1. Template DNA Template DNA adalah molekul DNA untai ganda yang mengandung sequen target yang akan diamplifikasi. Ukuran DNA bukan merupakan faktor utama keberhasilan PCR, berapapun panjangnya jika tidak mengandung sequen yang diinginkan maka tidak akan berhasil proses suatu PCR, namun sebaliknya jika ukuran DNA tidak terlalu panjang tapi mengandung sequen yang diinginkan maka PCR akan berhasil Sulistyaningsih, 2007. DNA cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 – 106 molekul. Dua hal penting tentang cetakan adalah kemurnian dan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta kuantitas atau konsentrasi Yusuf, 2010. Jika konsentrasinya terlalu rendah maka primer mungkin tidak dapat menemukan target dan jika konsentrasi terlalu tinggi akan meningkatkan kemungkinan mispriming. Disamping itu perlu diperhatikan kemurnian template karena akan mempengaruhi hasil reaksi Sulistyaningsih, 2007. 2. Primer Susunan primer merupakan salah satu kunci keberhasilan PCR. Pasangan primer terdiri dari 2 oligonukleotida yang mengandung 18-28 nukleotida dan mempunyai 45-60 GC content yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA Yusuf, 2010. Sequen primer yang lebih pendek akan memicu a mplifikasi produk PCR non spesifik. Ujung 3’ primer penting dalam menentukan spesifisitas dan sensitivitas PCR. Ujung ini tidak boleh mempunyai 3 atau lebih basa G atau C, karena dapat menstabilisasi annealing primer non spesifik. Disamping itu ujung 3’ kedua primer tidak boleh komplementer satu dengan yang lain, karena hal ini akan mengakibatkan pembentukan primer-dimer yang akan menurunkan hasil produk yang diinginkan. Ujung 5’ primer tidak terlalu penting untuk annealing primer, sehingga memungkinkan untuk menambahkan sequen tertentu misalnya sisi restriksi enzim, start codon ATG atau sequen promoter Sulistyaningsih, 2007. Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal dan akhir DNA target. Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA synthesizer Gaffar, 2007 Spesifisitas PCR sangat tergantung pada suhu melting Tm primer, yaitu suhu dimana separuh jumlah primer annealing pada template. Tm kedua primer serupa dalam 2-4 C dan diatas 60 C. Konsentrasi primer biasanya optimal pada 0,1-0,5 µM. Konsentrasi primer yang terlalu tinggi akan menyebabkan mispriming penempelan pada tempat yang tidak spesifik dan akumulasi produk non spesifik serta meningkatkan kemungkinan terbentuk primer-dimer, sebaliknya bila konsentrasi primer terlalu sedikit maka PCR menjadi tidak efisien sehingga hasilnya rendah Sulistyaningsih, 2007. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3. DNA polymerase DNA polymerase adalah enzim yang mengkatalisis polimerisasi DNA. Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini ternyata tidak aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Dalam perkembangannya, kini banyak digunakan enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi sehingga penambahan enzim tidak perlu dilakukan disetiap siklus dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin Gaffar, 2007. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut Thermus aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman Yellowstone pada tahun 1969. Enzim polimerase Taq tahan terhadap pemanasan berulang-ulang karena akan membantu melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder Yusuf, 2010 Enzim Taq DNA polymerase terdiri atas dua macam yaitu enzim alami yang diisolasi dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzim rekombinan yang disintesis didalam sel bakteri Escherichia coli Muladno, 2010. Enzi m ini masih mempunyai aktivitas eksonuklease dari 5’ ke 3’ tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease dari 3’ ke 5’. Konsentrasi enzim yang dibutuhkan untuk PCR biasanya 0,5-2,5 unit. Kelebihan jumlah enzim mengakibatkan akumulasi produk non spesifik, sedangkan jika terlalu rendah maka dihasilkan sedikit produk yang diinginkan Sulistyaningsih, 2007. 4. Deoxynucleotide Triphosphate dNTP Deoxynucleotide Triphosphate merupakan material utama untuk sintesis DNA dalam proses PCR yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP. dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah konsentrasi efektif ion. Ini yang diperlukan untuk reaksi polimerasi Yusuf, 2010. Konsentrasi dNTP masing-masing sebesar 20-200 µM dapat menghasilkan keseimbangan optimal antara hasil, spesifisitas dan