UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 2. Tahapan Proses Fluoresensi Hydrolysis Probe
No Gambar
Keterangan Hydrolysis Probe membawa dua
fluorescent dye berdekatan dengan quencher
dye menekan
sinyal fluorescent reporter
. Ujung 3’ dari probe terfosforilasi sehingga tidak
dapat memanjang selama PCR. Di tahap annealing, primer dan
probe sama-sama menempel ke urutan basa pada target spesifik
Ketika DNA
polimerase memanjangkan primer dan bertemu
dengan probe. Kemudian memecah probe pada ujung 5’ sehingga
menggantikan posisinya dan terus memanjang
sampai membentuk
amplikon baru. Saat probe terpecah, reporter tidak
lagi berdekatan dengan quencher sehingga
dapat mengeimisikan
cahaya fluorescent yang dibaca oleh detektor. Semakin tinggi flurosens
yang dipancarkan dari reporter secara langsung berkorelasi dengan
akumulasi pelepasan
molekul reporter dye sekaligus menandakan
jumlah produk
PCR yang
dihasilkan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Hydrolysis probe biasa digunakan dalam multipleks quantitative Real- Time PCR yang menggunakan DNA target dan pasangan lebih dari satu
dalam satu reaksi karena probe akan berikatan secara spesifik dengan beberapa DNA target yang berbeda BioRad, 2006. Metode Hydrolysis probe
memiliki keunggulan dibandingkan dengan SYBR Green karena dapat mengamplifikasi DNA lebih spesifik Izzah, 2014.
Pewarna fluorescent yang digunakan dalam Hydroysis probe bermacam ragamnya yang disesuaikan dengan penggunaannya. Metode Hydrolysis
probe dapat digunakan secara terpisah atau dengan kombinasi pewarna. Dalam penggunaannya dengan format deteksi monocolor biasa digunakan
reporter FAM dengan nilai eksitasi dan emisi berturut-turut 483 dan 533, pewarna lainnya yang tersedia untuk deteksi multicolor antara lain Cyan 500,
Hex, Red 610 dan Cy 5 dengan nilai eksitasi dan emisi dalam keadaan normal berturut turut 450 dan 500, 523 dan 568, 558 dan 610 serta 615 dan 670.
Sebagai quencher terutama untuk deteksi multicolor digunakan quencher dye gelap, direkomendasikan menggunakan BHQ1 atau DABCYL Roche
a
, 2008
27
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
3.1.1 Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisa Obat dan Pangan Halal dan Laboratorium Penelitian II Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. 3.1.2
Waktu
Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan dari bulan Maret 2014 hingga Desember 2014.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Real-Time PCR LightCycler® 480 - Roche, Multiwell plate 96 Roche, Spektrofotometer UV DNA BioDrop DUO, Refrigerated
Microcentrifuge 5417R – Eppendorf, Timbangan Analitik. Mikropipet
0,5-10 μl; 2-20 μl; 20-200 μl Biorad, Mikrotips volume 10 μl; 200 μl;
1000 μl Genfollower, PCR tube dan microcentrifuge tube volume 1,5 μl Biogenix, Microcentrifuge Wiggenhauser, Vortex Wiggenhauser,
Filter tube dan Collection tube Kit High Pure PCR Template Preparation - Roche, Digital waterbath Eyela, Pisau steril, dan Alat gelas yang
digunakan adalah Gelas ukur 100 ml, Gelas beker 500 ml Pyrex, Kaca arloji, Spatula, dan Batang pengaduk.
3.2.2 Bahan
Daging sapi segar, daging babi segar, 7 produk bakso sapi yang beredar di sekitar kampus UIN Jakarta; 1 produk bakso sapi yang berada
di pusat perbelanjaan di sekitar kampus UIN Jakarta, satu set reagen isolasi DNA yang terdiri dari Tissue Lysis Buffer; Binding Buffer;
Proteinase K; Inhibitor Removal Buffer; Washing Buffer; dan Elution Bufffer Kit High Pure PCR Template Preparation, ddH
2
O Roche, Aqua bidest IKA pharmindo, Isopropanol dan Etanol absolut Merck, Probe
Master Roche, primer dan probe.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 3. Susunan basa primer dan probe untuk DNA sapi dan babi
Tanabe et a.l, 2007 Babi Forward
5’-CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3’ Reverse
5’-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3’ Probe
5’-FAM-ACAGCTTTCTCATCAGTTAC-BHQ1-3’ Sapi
Forward 5’-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3’
Reverse 5’-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3’
Probe 5’-FAM-CATCATAGCAATTGCC-BHQ1-3’
3.3 Tahapan Penelitian
1. Pengumpulan sampel 2. Isolasi DNA sampel dan kontrol
3. Analisis Isolat DNA 4. Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR
3.4 Prosedur Kerja
3.4.1 Pengumpulan sampel
Pengumpulan sampel dilakukan terhadap 8 sampel bakso sapi dengan produsen berbeda yang beredar di wilayah Ciputat. 6 sampel dipilih secara
random dari produsen tradisional yang menjajakan produknya dengan menetap di kios permanen di sekitar kampus UIN Syarif Hidayatullah. 2
sampel lainnya diperoleh dari produsen yang produknya telah memiliki merek dagang branded, telah luas dikenal masyarakat dan memiliki
banyak cabang selain di sekitar Ciputat. Pengumpulan sampel dilakukan pada tanggal 10 November 2014 dengan cara membeli secara tunai.
Sampel dari produsen tradisional didapatkan dalam keadaan belum di hidangkan sedangkan sampel branded diperoleh dalam keadaan siap saji
lengkap dengan bumbu-bumbu penyedap, rempah-rempah maupun kuah kaldu panas yang biasa menyertainya.
3.4.2 Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakan kit isolasi High Pure PCR Template Preparation dengan protokol sesuai yang di anjurkan oleh produsen
lampiran 3.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.2.1 Preparasi Sampel
a. Daging Segar Masing-masing daging sapi segar maupun daging babi segar
dihaluskan dengan cara dicincang menggunakan pisau steril. Daging yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 50 mg dan kemudian
dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube. Proses ini dilakukan di tempat yang terpisah dan menggunakan alat yang berbeda bagi setiap
sampel dengan menjaga kebersihan alat yang digunakan. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya kontaminasi
b. Bakso sampel dan kontrol Simulasi bakso dibuat mengacu kepada resep tradisional dengan
perlakuan yang sama baik pada pembuatan bakso sapi maupun babi. 50 g daging yang telah di haluskan di campur dengan 100 g tepung terigu
dan 100 g tepung kanji, tambahkan 100 ml air sedikit demi sedikit sambil di aduk merata perlahan-lahan. Untuk penyedap ditambahkan 3
siung bawang putih yang telah di haluskan, aduk sampai terbentuk adonan. Adonan kemudian dibentuk menyerupai bola, seperti bakso
lalu direbus dengan air mendidih hingga mengambang. Semua proses dilakukan menggunakan alat yang terpisah serta tempat pengerjaan
yang berbeda untuk menghindari kontaminasi. Setelah menjadi bakso, potong menjadi 2 bagian sama besar. Pada
bagian dalam di posisi tengah bakso yang telah terpotong, sayat secukupnya daging bakso tersebut. Sayatan bakso kemudian dicincang
hingga halus dan ditimbang sebanyak 50 mg, masukkan ke dalam microsentrifuge tube dan sampel siap dilanjutkan ke proses
selanjutnya. Proses ini juga berlaku bagi sampel bakso yang dikumpulkan dari produsen dengan terlebih dahulu mencuci bakso
yang didapatkan menggunakan air mengalir sebelum di lakukan preparasi.
3.4.2.2 Proses Melisiskan Sampel dan Mengikat DNA Roche
b
,2012
Tambahkan 200 µl Tissue Lysis Buffer, 40 µl Proteinase K, vortex hingga homogen, inkubasi di dalam Digital waterbath sekitar 20 jam atau
semalaman pada suhu 57
o
C hingga jaringan terlarut sempurna.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Larutan yang terbentuk ditambah dengan 200 µl Binding Buffer, vortex hingga homogen dan inkubasi kembali pada suhu 70
o
C selama 10 menit. Lanjutkan dengan penambahan isopropanol 100 µl, vortex hingga
homogen. Untuk menghilangkan partikel-partikel tidak larut bisa dilakukan dengan mempipet larutan dengan micro pipet 1ml. Ketika cairan
dikeluarkan maka partikel-partikel tidak larut akan tertinggal di tips. Masukkan cairan yang telah bebas dari partikel tidak larut ke dalam
filter tube yang telah dipasangkan dengan collection tube. Sentrifugasi menggunakan refrigerated centrifuge selama 1 menit dengan putaran 8700
rpm. DNA akan tertinggal pada kapas fiberglas di filter tube. Siap untuk proses pemurnian dan elusi.
3.4.2.3 Proses Pemurnian dan Elusi DNA Roche
b
,2012
Buang collection tube beserta cairan yang tertampung didalamnya. Filter tube yang mengandung DNA dipasangkan kembali dengan
collection tube baru, kemudian tambahkan 500 µl inhibitor removal buffer ke dalam filter tube. Sentrifugasi kembali dengan putaran 8700 rpm
selama 1 menit. Lepaskan filter tube dan kembali pasangkan dengan collection tube
baru. Buang collection tube beserta cairan yang ditampungnya. Tambahkan 500 µl wash buffer ke dalam filter tube, lakukan sentrifugasi
dengan putaran 8700 rpm selama 1 menit. Proses sebelumnya diulangi untuk benar-benar didapatkan DNA yang
murni. Lepaskan filter tube dan kembali pasangkan dengan collection tube baru. Buang collection tube beserta cairan yang ditampungnya.
Tambahkan 500 µl wash buffer ke dalam filter tube, lakukan sentrifugasi dengan putaran 8700 rpm selama 1 menit kembali. Tahap akhir pemurnian
setelah cairan di dalam collection tube dibuang, pasangkan kembali filter tube dan collection tube tersebut. Kemudian sentrifugasi dengan kecepatan
maksimum yakni 15000 rpm selama 10 detik. Untuk mengelusi DNA, pasangkan filter tube dengan microsentrifuge
tube baru yang bersih dan steril. Tambahkan 200 µl elution buffer yang sebelumnya telah dihangatkan pada suhu 70
o
C. Sentrifugasi dengan
