sehingga bakteri yang ditambahkan dihambat pertumbuhannya pada daerah berupa lingkaran atau ”zona” disekeliling silinder yang berisi larutan antibiotik. Metode
turbidimetri berdasarkan atas hambatan pertumbuhan biakan mikroba dalam larutan serba sama antibiotik dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba dengan
cepat bila tidak terdapat antibiotik Ditjen POM, 1995. Pengujian antimikroba dilakukan untuk mengukur respon pertumbuhan
populasi mikroorganisme terhadap agen antimikroba. Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan efesien. Ada dua
metode utama dalam pengujian antimikroba, yaitu:
a. Metode Difusi
Metode difusi merupakan salah satu metode yang sering digunakan, metode difusi dapat dilakukan dalam 5 cara menurut Pratiwi 2005, yaitu metode disc diffusion tes
Kirby Bauer, e-test, disc-plate technique, cup-pate technique, gradient-palte technique.
Penentuan aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan metode difusi agar, diantaranya dimana menggunakan piringan yang berisi agen antimikroba, kemudian
diletakkan pada media agar yang sebelumnya telah ditanami mikroorganisme sehingga agen antimikroba dapat berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih
mengindikasi adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan agar Aziz, 2010.
b. Metode Dilusi
Metode dilusi metode pengenceran merupakan metode yang dilakukan dengan mengencerkan zat antimikroba dan dimasukkan kedalam tabung-tabung reaksi
steril.Masing-masing tabung tersebut ditambahkan sejumlah mikroba uji yang telah diketahui jumlahnya. Pada interval tertentu, dilakukan pemindahan dari tabung reaksi
ke dalam tabung-tabung berisi media steril kemudian diinkubasi dan
Universitas Sumatera Utara
diamatipenghambatan pertumbuhan Kusmiyati dan Agustini, 2007. Menurut Pratiwi 2008, metode dilusi dibedakan menjadi dua, yaitu dilusi cair bruch dilutiondan
dilusi padat solid dilution.
2.6. Bakteri
Bakteri merupakan penghasil bermacam-macam zat organik dan obat-obatan antibiotik. Mikroorganisme memang peranan penting dalam menganalisis sistem
enzim dan dalam mengalisis komposisi suatu makanan. Bakteri merupakan organisme yang sangat kecil berukuran mikroskopis. Bakteri rata-rata berukuran
lebar 0,5 – 1 mikron dan panjang hingga 10 mikron 1 mikron - 10
3
mm. Untuk melihat bakteri dengan jelas, tubuhnya perlu diisi dengan zat warna, pewarna ini
disebut pengecatan bakteri Irianto, 2006 Ada kalanya suatu bakteri perlu diwarnai dua kali. Setelah zat warna yang
pertama ungu terserap, maka bakteri dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi dengan zat warna berlainan, yaitu dengan zat warna merah. Zat warna tambahan
terhapus, sehingga yang nampak adalah zat asli ungu. Dalam hal ini bakteri disebut Gram Positif. Jika zat warna tambahan merah yang bertahan sehingga zat warna asli
tidak tampak, dalam hal ini bakteri disebut Gram Negatif. Beberapa bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yang penting dan diketahui dapat menyebabkan
kerusakan pangan dan keracunan pangan dan perbedaan gram positif dan gram negative dilihat pada table 2.1 Irianto, 2006.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 2.1. Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan bakteri gram negatif dapat
dilihat sebagai berikut Fardiaz, 1992
No. Sifat
Perbedaan relatif Bakteri gram +
Bakteri gram -
1. Komposisi
Kandungan lipid Kandungan lipid
dinding sel rendah1-4
11-22 2.
Ketahanan terhadap
Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin 3.
Penghambatan oleh pewarna
Lebih dihambat Kurang dihambat
basa misalnya violet Kristal
4. Kebutuhan
Kebanyakan Relatif sederhana
nutrien spesies relative kompleks
5. Ketahanan
terhadap perlakuan Lebih tahan
Kurang tahan
2.6.1. Bakteri Gram Positif Streptococcus Mutans
S. mutans pertama kali diisolasi dari plak gigi oleh Clark pada tahun 1924. Klasifikasi bakteri tersebut adalah sebagai berikut :
Kingdom : Monera
Divisi : Firmicutes
Class : Bacilli
Ordo : Lactobacillales
Family : Streptococcaceae
Universitas Sumatera Utara
Genus : Streptococcus
Species : Streptococcus mutans Anonim, 2012
S. mutans tumbuh pada suhu 18-40 C dalam suasana fakultatif anaerob,
sehingga bakteri ini dapat tumbuh dengan atau tanpa oksigen. Ketika oksigen sudah tidak tersedia, maka respirasi bakteri ini yang mulanya aerob akan berubah menjadi
anaerob, sehingga terjadi fermentasi fruktosa menjadi asam laktat yang mampu merusak gigi dan penyakit yang disebabkan adalah karies gigi, beberapa hal yang
menyebabkan karies gigi bertambah parah adalah seperti gula, air liur, dan juga bakteri pembusuknya. Setelah memakan sesuatu yang mengandung gula, terutama
adalah sukrosa, dan bahkan setelah beberapa menit penyikatan gigi dilakukan, glikoprotein yang lengket kombinasi molekul protein dan karbohidrat bertahan
pada gigi untuk mulai pembentukan plak pada gigi bakteri S.mutans dapat dilihat pada gambar 2.7 Gani, AB, 2006
Gambar 2.8. Streptococcus Mutans
2.6.2. Bakteri Gram Negatif Pseudomonas aeruginosa
Berikut sistematika bakteri Pseudomonas aeruginosa Dwidjoseputro, 1988 adalah sebagai berikut :
Divisi : Protophyta
Kelas : Schizomycetes
Bangsa : Pseudomonadales
Suku : Pseudomonadaceae
Universitas Sumatera Utara
Marga : Pseudomonas
Jenis : Pseudomonas aeruginosa
bakteri Pseudomonas aeruginosa dapat dilihat pada gambar 2.9.
Gambar 2.9. Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa dapat menginfeksi seseorang yang mengalami
gangguan pada sistem pertahanan tubuhnya, misalnya pada orang yang menderita luka bakar, pada orang yang mengalami gangguan metabolisme dan pada penderita
yang mendapat pengobatan radiasi.Bakteri ini dapat menginfeksi hampir seluruh jaringan tubuh yang masuk melalui lesi lokal yang ada di permukaan tubuh.
Selanjutnya akan memasuki pembuluh darah dan menyebar pada jaringan tubuh yang lain. Bakteri ini adalah bakteri gram negatif aerob obligat, berkapsul, mempunyai
flagella polar sehingga bakteri ini bersifat motil, berukuran sekitar 0,5- 1,0 μm, tidak
menghasilkan spora dan tidak dapat menfermentasikan karbohidrat. Pada uji biokimia, bakteri ini menghasilkan hasil negatif pada uji indol, merah
metil, dan voges - proskauer. Bakteri ini secara luas dapat ditemukan di alam, contohnya di tanah, air, tanaman, dan hewan. Pseudomonas aeruginosa adalah
patogen oportunistik. Bakteri ini merupakan penyebab utama infeksi pneumonia nosokomial. Meskipun begitu, bakteri ini dapat berkolonisasi pada manusia normal
tanpa menyebabkan penyakit. Ketika bakteri ini ditumbuhkan pada media yang sesuai, bakteri ini akan menghasilkan pigmen nonfluoresen berwarna kebiruan,
piosianin. Pseudomonas aeruginosa memproduksi katalase, oksidase, dan amonia dari arginin Pelczar, 1988.
Universitas Sumatera Utara
BAB 3 METODOLOGI PERCOBAAN
3.1. Alat-alat
- Alat Stahl
- GC-MS
Shimadzu -
Gelas Erlenmeyer 250 mL
Pyrex -
Gelas ukur 100mL
Pyrex -
Bekker glass 100mL
Pyrex -
Labu ukur 25 mL
Pyrex -
Labu ukur 100 mL
Pyrex -
Tabung reaksi Pyrex
- Labu destilasi
2000mL -
Pipet Volume Pyrex
- Bola Karet
- Hot Plate
Cimarec2 -
Panci -
Inkubator Fiber Scientific
- Jarum Ose
- Syringe
- Batang pengaduk
- Pinset
-
Pipet Mikro Eppendorf
-
Spatula -
Botol Vial -
Pipet tetes -
Cawan petri -
Bunsen -
Kertas cakram Oxoid
Universitas Sumatera Utara
- Kain Kasa
-
Benang -
Jangka sorong -
Aluminium foil -
Autoklaf Yamato SN20
- Fortex
Fisons whirh mixer -
Kapas -
Neraca analitis Mettler AE 2000
- Spektrofotometer UV-Visible
Spectronic 300
- Oven
Fisher Scientific
- Lemaripendingin
Toshiba
3.2. Bahan- bahan
- Bungakemangi
- Na
2
SO
4
Anhidrous p.a Merck
- Etanol p.a
p.a Merck -
Dimetil sulfoksida DMSO p.a Merck
- Nutrien Agar NA
p.a. Oxoid -
Muller Hinton Agar MHA p.a. Oxoid
- Nutrien Broth NB
p.a. Oxoid -
Larutan Standart Mcfarland -
Aquadest -
DPPH2,2-diphenyl-1-picryl –hydrazil p.a Aldrich
- DMSO dimetilsulfoksida
` p.a Fisons
- Pseudomonas Aeruginosa
- StreptoccocusMutans
Universitas Sumatera Utara
3.3. Prosedur Penelitian 3.3.1. Penyediaan Sampel
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah bungakemangi yang diperoleh dari daerah Padang Bulan Medan
3.3.2. Isolasi Minyak Atsiri Bunga Kemangi dengan Alat Destilasi Stahl
Sebanyak 400 gram bunga kemangi segar dipotong kecil-kecil dan dimasukkan kedalam labu alas 2000 mL ditambahkan aquadest sebanyak 500mL, dipasang pada
alat penyuling Stahl, dan dididihkan selama ± 4-5 jam hingga minyak atsiri menguap sempurna. Destilat yang diperoleh merupakan campuran minyak dengan air.
Kemudian lapisan minyak dipipet dan dimasukkan kedalam botol vial, ditambahkan Na
2
SO
4
anhidrous pada botol vial untuk mengikat air yang mungkin masih tercampur dengan minyak atsiri dan disimpan dilemari pendingin 4
o
C, dalam botol dan ditutup rapat.Kemudiandidekantasi,minyak yang diperoleh dianalisa kandungan kimianya
menggunakan alat GC-MS dan dilakukan uji aktivitas terhadap bakteri serta
antioksidan. 3.3.3. Analisis Minyak Atsiri BungaKemangi dengan GC-MS
Cuplikan dimasukkan kedalam gerbang suntik pada sebuah alat GC-MS. Selanjutnya kondisi disesuaikan dengan kondisi dibawah ini kemudian diamati kromatogram yang
dihasilkan oleh recorder dan mass recorder serta mass spektra masing-masing senyawa. Kondisi GC-MS yang di gunakan analisa minyak atsiri bunga kemangi
seperti dibawah ini :
GCMS – QP2010S SHIMADZU Kolom
: AGILENT HP 5MS Panjang
: 30 meter Gas Pembawa
: Helium Pengion
: EI
Universitas Sumatera Utara
[GC-2010] Column Oven Temperature : 100
o
C Injection Temperature
: 290
o
C Injection Mode
: Split Flow Control Mode
: Pressure Pressure
: 13.7kPa Total Flow
: 60.0mLmin Column Flow
: 0.50 mLmin Linear Velocity
:25.9 cmsec Purge Flow
:3.0 mLmin Split Ratio
: 113 Equilibrium Time
: 1.0min [GCMS-QP2010]
Ion Source Temperature : 250
o
C Interface Temperature
:305
o
C Solvent Cut Time
: 2.80min Detector Gain Mode
: Relative Detector Gain
: 0,00kV [MS]
Start Time : 3.00min
End time : 70min
ACQ Mode : Scan
Event Time : 0.50sec
Scan Speed :1250
Universitas Sumatera Utara
Start mz : 28
End mz :600
3.3.4. Uji Sifat Antioksidan Minyak Atsiri Bunga Kemangi Dengan Metode
DPPH 3.3.4.1.Pembuatan Larutan DPPH
Larutan DPPH 0,3mM dibuat dengan melarutkan 11,83 mg serbuk DPPH dalam etanol p.a dalam labu takar 100 ml, kemudian dihomogenkan
3.3.4.2.Pembuatan Variasi Minyak Atsiri BungaKemangi
Minyak Atsiri Bunga kemangi dibuat larutan induk 1000 ppm ; dengan melarutkan 0,025 g minyak atsiri dengan pelarut etanol p.a dalam labu takar 25 ml. Kemudian
dari larutan induk dibuat larutan 100 ppm, dari larutan 100 ppm dibuat lagi variasi konsentrasi2,5, 5, 7,5 dan 10 ppm untuk uji aktivitas antioksidan
3.3.4.3.Uji Aktivitas Antioksidan a. Uji AktivitasAntioksidan Larutan Blanko
Sebanyak 2,5 ml etanol absolute di tambahkan 1 ml larutan DPPH 0,3mM dalam tabung reaksi dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap.
Setelah itu, diukur absorbansi dengan panjang gelombang maksimum 515 nm.
b. Uji Aktivitas Antioksidan Sampel
Sebanyak 0,6 ml Minyak atsiri bunga kemangi dengan konsentrasi 2,5 ppm ditambahkan 1 ml larutan DPPH 0,3 mM , dihomogenkan dan dibiarkanselama 30
menit. Setelah itu diukur absorbansi dengan panjang gelombang maksimum 515 nm. Dilakukan dengan perlakuan yang sama untuk konsentrasi 5, 7,5 dan 10 ppm.
Universitas Sumatera Utara
3.3.5. Pengujian Sifat Antibakteri Minyak Atsiri Bunga Kemangi Ocimum
basilicum L 3.3.5.1. Pembuatan Media Nutrien Agar NA
Sebanyak 7 g nutrient agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 250 ml aquades dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Lalu disterilkan di
autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit.
3.3.5.2. Pembuatan Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri
Kedalam tabung reaksi yang steril dimasukkan 3 ml media nutrient agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk
sudut 30-45º. Biakan bakteri Streptococcus Mutansdari strain utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasikanpadapermukan media nutrient agar miring dengan
cara menggores,kemudiandiinkubasipadasuhu 35 ± 2 C selama 18-24 jam. Hal yang
sama juga dilakukan pada biakan bakteri Pseudomonas aeruginosa.
3.3.5.3. Pembuatan Media Mueller Hinton Agar MHA
Sebanyak 8 g serbuk Mueller Hinton Agar dimasukkan dalam Erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 250 ml aquades dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih.
Lalu disterilkan di autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit.
3.3.5.4. Penyiapan Inokulum Bakteri
Sebanyak 3,25 g nutrient broth dilarutkan dengan 250 ml aquades dalam Erlenmeyer dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih, kemudian disterilkan di autoklaf
121ºC selama 15 menit dan didinginkan. Lalu koloni bakteri Streptococcus mutans diambil dari stok kultur menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke
dalam 10 ml media nutrient broth steril dalam tabung reaksi dan diinkubasikan pada suhu 35 ± 2
o
C selama ± 3 jam, lalu dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan standar mcfarland. Hal yang sama juga dilakukan untuk koloni bakteri Pseudomonas
aeruginosa.
Universitas Sumatera Utara
3.3.5.5. Pembuatan Variasi Konsentrasi Minyak Atsiri BungaKemangi Ocimumbasiliccum L
Minyak Atsiri dibuat dalam konsentrasi 10, 20, 30vv. Minyak Atsiri masing- masing dipipet sebanyak 0,5 ml, 1 ml, dan 1,5 ml kemudian diencerkan dalam labu
takar 5 ml ditambahkan dimetilsulfoksida DMSO hingga garis tanda kemudian dihomogenkan.
3.3.5.6.Uji Aktivitas Antibakteri Bunga Kemangi Ocimumbasiliccum L
Sebanyak 0,1 ml inokulum Streptococcusmutans dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media Mueller Hinton Agar sebanyak 15 ml dengan suhu
45 – 50
o
C dihomogenkan sampai media dan bakteri tercampur rata, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam
dengan minyak atsiri bunga kemangi dengan berbagai konsentrasi kedalam cawan petri yang telah berisi bakteri , kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35 ±
2
o
C selama 18-24 jam. Selanjutnya diukur diameter daerah hambat di sekitar larutan penguji. Dilakukan dengan cara yang sama terhadap bakteri Pseudomonas
aeruginosa.
Universitas Sumatera Utara
3.4. Bagan Penelitian 3.4.1. Isolasi Minyak Atsiri Bunga kemangi dengan Destilasi Stahl
Dimasukkan kedalam labu Stahl 2 liter Ditambahkan aquadest sebanyak 500 ml
Dirangkai alat Stahl Dipanaskan hingga keluar uap air bersama
minyak
Dimasukkankedalambotol vial Ditambahkan Na
2
SO
4
Anhidrous Didekantasi
Diukur volumenya 400 gram BungaKemangi Segar yang telah dibersihkan
Lapisan Minyak Lapisan Air
Minyak Atsiri Residu
Analisa GC-MS UjiAntioksidan
Uji Antibakteri
Universitas Sumatera Utara
3.4.2. Uji Sifat Antioksidan Minyak Atsiri BungaKemangi dengan Metode DPPH
3.4.2.1. Pembuatan Larutan DPPH 0,3mM
Dimasukkan kedalam labu takar 100 ml Dimasukkan etanol p.a hingga garis batas
dihomogenkan 11,83 mg DPPH
Larutan DPPH 0,3mM
Universitas Sumatera Utara
3.4.2.2. Pembuatan variasi Minyak Atsiri BungaKemangi
Dimasukkan dalam labu takar 25 ml Ditambahkan etanol p.a hingga garis tanda
Dihomogenkan
Dipipet 2,5 ml larutan induk 1000 ppm Dimasukkan kedalam labu takar 25 ml
Ditambahkan etanol p.a hingga garis tanda Dihomogenkan
Dibuat variasi konsentrasi 2,5, 5, 7,5 dan 10 ppm
dipipet 0,6ml dipipet 1.2ml dipipet 1,8 ml
dipipet 2.5 ml dengan pipet dengan pipet
dengan pipet dengan pipet volume
volume volume
volume dimasukkan dimasukkan dimasukkan dimasukkan
dalam labu dalam labu dalam labu
dalam labu takar 25 ml takar 25 ml takar 25 ml
takar 25 ml
ditambahkan ditambahkan ditambahkan ditambahkan
etanol p.a etanol p.a etanol p.a
etanol p.a hingga garis hingga garis hingga garis hingga garis
batas batas
batas batas
dihomogen dihomogen
dihomogen dihomogen kan
kan kan
kan 0,025 gram Minyak Atsiri
25 mL Larutan Induk 1000
25 ml larutan induk 100 ppm
10 ppm 7.5ppm
5ppm 2.5ppm
Universitas Sumatera Utara
3.4.2.3. Uji Aktivitas Antioksidan a. Uji Blanko
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Ditambahkan 2,5 mL etanol p.a Dihomogenkan
Dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap Diukur absorbansi pada panjang gelombang
maksimum 515nm
b. Uji Minyak Atsiri
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Ditambahkan 0.6 ml minyak atsiri 2.5 ppm
Dihomogenkan Dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap
Diukur absorbansi pada panjang gelombang maksimum 515nm
Dilakukan perlakuan yang sama terhadap variasi konsentrasi 5, 7.5, dan 10 ppm 1 mL larutan DPPH 0,3 mM
Hasil
Hasil 1 mL larutan DPPH 0,3 mM
Universitas Sumatera Utara
3.4.3. Pengujian Sifat Antibakteri Minyak Atsiri BungaKemangi 3.4.3.1. Pembuatan Media Nutrien Agar NA Miring dan Stok Kultur
Bakteri
Dilarutkan dengan 250 mL aquadest dalam erlenmeyer
Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit
Dituangkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 3 ml Dibiarkan pada temperature kamar sampai memadat
Pada posisi miring menbentuk sudut 30-45
o
Diambil biakan bakteri Streptococcus Mutans dari strain utama dengan jarum oselalu digoreskan pada media NA yang telah
memadat Diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35
o
C
Dilakukan perlakuan yang sama terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa 7 gram Media NA Nutrien Agar
Media NA Nutrien Agar Steril
StokkulturbakteriStreptococ cus mutans
Universitas Sumatera Utara
3.4.3.2. Pembuatan Media Mueller Hinton Agar MHA
dilarutkan dengan 250 ml aquadest dalam erlenmeyer dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit
8 gram Media Mueller Hinton Agar MHA
Media MHA steril
Universitas Sumatera Utara
3.4.3.3.Penyiapan Inokulum Bakteri
Dilarutkan dengan 250 ml aquadest dalam erlenmeyer Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih
Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit
Dimasukkan sebanyak 10 ml kedalam tabung reaksi
Diambil koloni bakteri Streptococcus Mutans dari stok kultur Bakteri dengan jarum ose
Disuspensikan kedalam media Nutrien Broth NB Diinkubasi pada suhu 35
o
C selama 3 jam Dibandingkan kekeruhannya dengan standar Mcfarland
Dilakukan hal yang sama pada koloni bakteri Pseudomonas aeruginosa 3 gram Media Nutrien Broth NB
Media NB Steril
Inokulum Bakteri Streptococcus Mutans
Universitas Sumatera Utara
3.4.3.4.Uji Aktivitas Antibakteri
Dimasukkan kedalam cawan petri Ditambahkan 15 mL MHA dengan suhu 45-50
o
C Dihomogenkan sampai media dan bakteri tercampur rata
Dibiarkan sampai media memadat Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam blanko
Dan minyak atsiri dengan pengenceran 10, 20, 30 vv Kedalam cawan petri yang berisi bakteri
Diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35
o
C
Diukur diameter zona bening disekitar kertas cakram Dengan jangka sorong
0,1 ml Inokulum Bakteri
Hasil
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian 4.1.1. Penentuan Kadar Minyak Atsiri
