BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Farmasi Kualitatif dan di Laboratorium Penelitian Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara
pada bulan Maret 2013 - Mei 2013.
3.2 Bahan-bahan 3.2.1 Sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah hati ayam buras dan hati ayam ras yang diambil secara purposif dari tempat yang berbeda di daerah
Sunggal Gambar dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 49. 3.2.2 Pereaksi
Pereaksi yang digunakan adalah pro analisis keluaran E.Merck yaitu HNO
3
65, larutan baku timbal 1000 µgml, larutan baku kadmium 1000 µgml, asam sulfat 95, dithizon 98, ammonium hidroksida 25, kloroform
99, kecuali akuabides PT. Ikapharmindo Putramas.
3.3 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spektrofotometer Serapan Atom Hitachi Zeeman-2000 lengkap dengan lampu Pb dan Cd,
Tanur Stuart, Kertas Whatman No. 42, Timbangan analitik Shimadzu, Blender, Botol kaca gelap, Kurs porselen, Cawan penguap, Spatula, Pipet tetes,
Universitas Sumatera Utara
Hot plate shott, Alat-alat gelas Pyrex dan Oberoi Gambar dapat dilihat pada Lampiran 2, Halaman 51.
3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Larutan HNO
3
1:1 vv
Larutan HNO
3
1: 1 vv dibuat dengan cara mengencerkan 500 ml HNO
3
65 bv diencerkan dengan air suling 500 ml Ditjen POM, 1979. 3.4.2 Larutan HNO
3
1 N
Larutan HNO
3
1 N dibuat dengan cara mengencerkan 69 ml HNO
3
65
diencerkan dengan air suling 1000 ml Ditjen POM, 1979. 3.4.3 Larutan Dithizon 0,005 bv
Larutan dithizon 0,005 bv dibuat dengan cara dithizon sebanyak 5 mg dilarutkan dalam 100 ml kloroform Ditjen POM, 1979.
3.4.4 Larutan NH
4
OH 1N
Larutan NH
4
OH 1 N dibuat dengan cara mengencerkan 7,4 ml NH
4
OH 25 diencerkan dengan air suling 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.4.5 Larutan KCN 10 bv
Larutan KCN 10 bv dibuat dengan cara Kristal KCN sebanyak 1 g dilarutkan dalam 10 ml air suling Ditjen POM, 1995.
3.5 Prosedur Penelitian 3.5.1 Pengambilan Sampel
Metode pengambilan sampel dilakukan dengan cara sampling purposif yang dikenal juga sebagai sampling pertimbangan dimana sampel ditentukan
Universitas Sumatera Utara
atas pertimbangan bahwa populasi sampel adalah homogen dan sampel yang tidak diambil mempunyai karakteristik yang sama dengan sampel yang sedang
diteliti Sudjana, 2005.
3.5.2 Penyiapan Bahan
Sampel berupa hati ayam buras dan hati ayam ras dicuci bersih dengan akuades kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender. Sampel yang
telah halus ditimbang masing-masing ± 5 gram dalam kurs porselin yang telah diberi kode sampel. Perlakuan penimbangan dan penetapan kadar timbal dan
kadmium dilakukan sebanyak 6 kali.
3.5.3 Proses Dekstruksi Kering Masing-masing hati ayam yang telah ditimbang sebanyak ± 5 gram
dalam kurs porselen, ditambah 10 ml HNO
3
p lalu didekstruksi menggunakan hot plate dengan suhu 100
o
C sampai mengarang, lalu diabukan di tanur, mula- mula pada temperatur 100
o
C dan secara perlahan-lahan dinaikkan interval 25
o
C setiap 5 menit sampai temperatur menjadi 500
o
C dan pengabuan dilakukan selama 36 jam. Setelah itu dibiarkan dingin di dalam desikator. Kemudian abu
dilarutkan dalam 10 ml HNO
3
1:1 dan dipanaskan di atas hot plate dengan suhu 100
o
C sampai kering, kemudian ditanur pada suhu 500
o
C selama 1 jam Isaac, 1990. Bagan alir proses dekstruksi kering dapat dilihat pada Lampiran
3, halaman 54.
3.5.4 Pembuatan Larutan Sampel
Hasil dekstruksi dilarutkan dalam 10 ml HNO
3
1:1 hingga larut sempurna, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml dan kurs
Universitas Sumatera Utara
porselin dibilas dengan akuabides sebanyak 3 kali. Hasil pembilasan dimasukkan ke dalam labu tentukur. Setelah itu dicukupkan volumenya dengan
akuabides hingga garis tanda. Kemudian disaring dengan kertas saring Whatman no. 42 dengan membuang 5 ml larutan pertama hasil penyaringan
untuk menjenuhkan kertas saring Isaac, 1990. Larutan ini digunakan untuk analisis kualitatif dan analisis kuantitatif timbal dan kadmium. Bagan alir
proses pembuatan larutan sampel dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 55. 3.5.5 Analisis Kualitatif
3.5.5.1 Timbal
Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 5 ml larutan sampel, diatur pH=8,5 dengan penambahan ammonium hidroksida 1N, dimasukkan kalium sianida,
ditambahkan 5 ml dithizon 0,005, dikocok kuat, dibiarkan lapisan memisah. Terbentuk warna merah tua berarti sampel mengandung Pb Fries dan Getrost,
1977.
3.5.5.2 Kadmium
Kedalam tabung reaksi dimasukkan 5 ml larutan sampel, diatur pH=6,5 dengan penambahan ammonium hidroksida 1 N, ditambahkan 5 ml dithizon
0,005 bv, dikocok kuat, dibiarkan larutan memisah. Terbentuk warna merah muda berarti sampel mengandung Cd Fries dan Getrost, 1977.
Universitas Sumatera Utara
3.5.6 Analisis Kuantitatif 3.5.6.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi
3.5.6.1.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi Timbal
Larutan standar timbal konsentrasi1000 µgml dipipet sebanyak 1 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambahkan 10 ml HNO
3
1 N dan
dicukupkan hingga garis tanda dengan akuabides konsentrasi 10 µgml.
Larutan standar timbal konsentrasi 10 µgml dipipet sebanyak 1 ml, dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml, ditambahkan 10 ml HNO
3
1 N dan dicukupkan hingga garis tanda dengan akuabides konsentrasi 0,1 µgml.
Larutan standar timbal konsentrasi 0,1 µgml dipipet sebanyak 5 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan 5 ml HNO
3
1 N dan dicukupkan hingga garis tanda dengan akuabides konsentrasi 0,01 µgml.
Larutan untuk kurva kalibrasi timbal dibuat dengan memipet larutan standar timbal konsentrasi 0,01 µgml sebanyak 1,25; 2,5; 3,75; 5; dan 6,25
ml. Dimasukkan masing-masing ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambahkan 2,5 ml HNO
3
1 N dan dicukupkan hingga garis tanda dengan akuabides larutan ini mengandung 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 dan 2,5 ngml dan diukur absorbansinya
pada panjang gelombang 283,3 nm dengan graphite furnace.
3.5.6.1.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Kadmium
Larutan standar kadmium konsentrasi 1000 µgml dipipet sebanyak 0,1 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambahkan 10 ml HNO
3
1 N
dan dicukupkan hingga garis tanda dengan akuabides konsentrasi 1 µgml.
Universitas Sumatera Utara
Larutan untuk kurva kalibrasi kadmium dibuat dengan memipet larutan standar kadmium konsentrasi 1 µgml sebanyak 0,4; 0,6; 0,8; 1 dan 1,2 ml.
Dimasukkan masing-masing kedalam labu tentukur 100 ml, dtambahkan 10 ml HNO
3
1 N dan dicukupkan hingga garis tanda dengan akuabides. Larutan ini mengandung 4; 6; 8; 10 dan 12 ngml dan diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 228,8 nm dengan nyala udara-asetilen.
3.5.6.2 Penetapan KadarTimbal dan Kadmium dalam Sampel 3.5.6.2.1 Penetapan Kadar Timbal dalam Sampel
Larutan sampel hasil destruksi diukur absorbansinya dengan menggunakan Spektrofotometer Serapan Atom pada panjang gelombang 283,3
nm dengan graphite furnace. Nilai absorbansi yang diperoleh harus berada dalam rentang nilai kurva kalibrasi larutan standar timbal. Konsentrasi timbal
dalam sampel ditentukan berdasarkan persamaan garis regresi dari kurva kalibrasi.
3.5.6.2.2 Penetapan Kadar Kadmium dalam Sampel
Larutan sampel hasil destruksi dipipet sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml dan di tambahkan 2,5 ml larutan HNO
3
1 N, lalu dicukupkan dengan akuabides hingga garis tanda Faktor pengenceran = 2510
kali. Lalu diukur absorbansinya dengan menggunakan Spektrofotometer Serapan Atom pada panjang gelombang 228,8 nm dengan nyala udara-asetilen.
Nilai absorbansi yang diperoleh harus berada dalam rentang nilai kurva kalibrasi larutan standar kadmium. Konsentrasi kadmium dalam sampel
ditentukan berdasarkan persamaan garis regresi dari kurva kalibrasi.
Universitas Sumatera Utara
Menurut Gandjar dan Rohman 2007, kadar timbal dan kadmium dalam sampel dapat dihitung dengan cara sebagai berikut:
Kadar ngg =
������ �
Keterangan: C = Konsentrasi logam dalam larutan sampel ngml
V = Volume larutan sampel ml Fp = Faktor pengenceran
W = Berat sampel g
3.5.7 Penentuan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Menurut Harmita 2004, batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat di deteksi yang masih memberikan respon signifikan.
Sebaliknya batas kuantitasi merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel
yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.
Batas deteksi dan batas kuantitasi ini dapat di hitung dengan rumus sebagai berikut:
Simpangan baku =
�
∑
�−��
2
�−2
Batas Deteksi LOD =
3��� �����
Batas Kuantitasi LOQ = 10 ���
�����
3.5.8 Uji Perolehan Kembali Recovery
Uji perolehan kembali atau recovery dilakukan dengan metode penambahan larutan standar standard addition method. Dalam metode ini,
Universitas Sumatera Utara
kadar logam dalam sampel ditentukan terlebih dahulu, selanjutnya dilakukan penentuan kadar logam dalam sampel setelah penambahan larutan standar
dengan konsentrasi tertentu Ermer, 2005. Larutan baku yang di tambahkan pada sampel yaitu sebanyak 0,25 ml
konsentrasi 100 µgml untuk logam timbal dan sebanyak 0,63 ml konsentrasi 100µgml untuk logam kadmium.
Sampel yang telah di timbang ± 5gram, ditambahkan 0,25 ml larutan
baku timbal konsentrasi 100 µgml dan 0,63 ml larutan baku kadmium konsentrasi 100 µgml, kemudian dilanjutkan dengan prosedur dekstruksi
kering seperti yang telah dilakukan sebelumnya. Prosedur pengukuran uji perolehan kembali dilakukan sama dengan prosedur penetapan kadar sampel.
Menurut Harmita 2004, persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus di bawah ini:
Persen Perolehan Kembali =
�
�−
�
�
�
� ∗
� 100
Keterangan: C
A
= Kadar logam dalam sampel sebelum penambahan baku C
F
= Kadar logam dalam sampel setelah penambahan baku C
A
= Kadar larutan baku yang ditambahkan
3.5.9 Simpangan Baku Relatif
Keseksamaan atau presisi diukur sebagai simpangan baku relatif atau koefisien variasi. Keseksamaan atau presisi merupakan ukuran yang
menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang homogen. Nilai simpangan baku
Universitas Sumatera Utara
relatif yang memenuhi persyaratan menunjukkan adanya keseksamaan metode yang dilakukan.
Menurut Harmita 2004, rumus untuk menghitung simpangan baku relatif adalah sebagai berikut:
RSD =
100 ×
X SD
Keterangan:
−
X = Kadar rata-rata sampel SD = Standar Deviasi
RSD = Relative Standard Deviation
3.5.10 Analisis Data Secara Statistik
Menurut Gandjar dan Rohman 2007, kadar timbal dan kadmium yang diperoleh dari hasil pengukuran masing-masing larutan sampel dianalisis
secara statistik dengan metode standar deviasi dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
SD = 1
- n
X -
Xi
2
∑
Keterangan: Xi = Kadar sampel X = Kadar rata-rata sampel
n = Jumlah pengulangan Kadar timbal dan kadmium yang diperoleh dari hasil pengukuran
masing-masing keenam larutan sampel, diuji secara statistik dengan uji Q. Untuk mengetahui data ditolak atau diterima dilakukan dengan uji Q
yang dapat dihitung dengan rumus: Q
hitung
= terendah
Nilai tertinggi
Nilai terdekat
yang Nilai
dicurigai yang
Nilai −
−
Universitas Sumatera Utara
Menurut Gandjar dan Rohman 2007, hasil pengujian atau nilai Q yang diperoleh ditinjau terhadap daftar harga Q pada Tabel 3.1, apabila Q
hitung
Q
kritis
maka data tersebut ditolak.
Tabel 3.1 Nilai Q
kritis
pada Taraf Kepercayaan 95
Menurut Sudjana 2005, untuk menentukan kadar timbal dan kadmium di dalam sampel dengan interval kepercayaan 95,
α = 0,05, dk = n-1, dapat di gunakan rumus:
µ = X ± t
½ α,dk
x SD √n
Keterangan : µ = Interval kepercayaan X = Kadar rata-rata sampel
t = Harga t tabel sesuai dengan dk = n-1 α = Tingkat kepercayaan
SD = Standar deviasi n = Jumlah pengulangan
Banyak Data Nilai Q
kritis
4 0,831
5 0,717
6 0,621
7 0,570
8 0,524
Universitas Sumatera Utara
3.5.11 Pengujian Beda Nilai Rata-rata
Menurut Sudjana 2005, sampel yang dibandingkan adalah independen dan jumlah pengamatan masing-masing lebih kecil dari 30 dan varians
σ tidak diketahui sehingga dilakukan uji F untuk mengetahui apakah varians
kedua populasi sama σ
1
= σ
2
atau berbeda σ
1
≠ σ
2
dengan menggunakan rumus:
F =
�
1 2
�
2 2
Keterangan : F = Beda nilai yang dihitung
S
1
= Standar deviasi sampel 1 S
2
= Standar deviasi sampel 2 Apabila dari hasilnya diperoleh F
o
tidak melewati nilai kritis F maka dilanjutkan uji dengan distribusi t dengan rumus:
t
o
=
�
1−
�
2
�� �1�
1
+ 1�
2
Sp
= �
�
1−
1�
1 + 2
�
1−
1�
2 2
�
1
+ �
2
−2
Keterangan: X
1
= Kadar rata-rata sampel 1 X
2
= Kadar rata-rata sampel 2 Sp = Simpangan baku
n
1
= Jumlah pengulangan sampel 1 n
2
= Jumlah pengulangan sampel 2 S
1
= Standar deviasi sampel 1 S
2
= Standar deviasi sampel 2
Universitas Sumatera Utara
Dan jika F
o
melewati nilai kritis F maka dilanjutkan uji dengan distribusi t dengan rumus:
t
o
=
�
1−
�
2
�� ��
1 2
�
1
+ �
2 2
�
2
Keterangan: X
1
= Kadar rata-rata sampel 1 X
2
= Kadar rata-rata sampel 2 Sp = Simpangan baku
n
1
= Jumlah pengulangan sampel 1 n
2
= Jumlah pengulangan sampel 2 S
1
= Standar Deviasi sampel 1 S
2
= Standar Deviasi sampel 2 Kedua sampel dinyatakan berbeda apabila t
o
yang diperoleh melewati nilai kritis t, dan sebaliknya.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dilakukan sebagai analisis pendahuluan untuk mengetahui ada atau tidaknya ion-ion timbal dan kadmium dalam sampel.
Analisis kualitatif ini dilakukan dengan penambahan larutan dithizon 0,005 . Data dan Gambar dapat dilihat pada tabel dan Lampiran 5, halaman56.
Tabel 4.1. Hasil Analisis Kualitatif dalam Sampel yang Telah di Dekstruksi
No. Sampel
Logam Pereaksi
larutan dithizon
0,005 bv Hasil Reaksi
1. Hati Ayam Buras Ternak
- 2.
Hati Ayam Buras Sawah -
3. Hati Ayam Buras Bebas
Pb pH 8,5
- 4.
Hati Ayam Ras Ternak 1 -
5. Hati Ayam Ras Ternak 2
- 6.
Hati Ayam Ras Ternak 3 -
1. Hati Ayam Buras Ternak
Merah muda 2.
Hati Ayam Buras Sawah Merah muda
3. Hati Ayam Buras Bebas
Cd pH 6,5
Merah muda 4.
Hati Ayam Ras Ternak 1 -
5. Hati Ayam Ras Ternak 2
- 6.
Hati Ayam Ras Ternak 3 -
Keterangan : Pb + : Merah tua Cd + : Merah muda
Tabel 4.1 di atas menunjukkan bahwa larutan sampel yang diperiksa mengandung ion kadmium. Reaksi dengan larutan dithizon 0,005 dapat
membedakan keberadaan ion timbal dan ion kadmium karena masing-masing ion ini akan memberikan warna pada pH yang berbeda. Pada pH 8,5 lapisan
kloroform memberikan warna merah tua yang menunjukkan adanya ion timbal
Universitas Sumatera Utara
dan pada pH 6,5 memberikan warna merah muda yang menunjukkan adanya ion kadmium pada sampel. Warna yang terbentuk adalah karena terbentuknya
kompleks logam dithizonat. Namun analisa untuk ion timbal pada sampel tidak memberikan warna. Hal ini disebabkan karena kadar ion timbal pada sampel
yang terlalu kecil sehingga tidak dapat terdeteksi. Kadar batas timbal yang dapat dideteksi dengan menggunakan dithizonat adalah 1 ppm Fries dan
Getrost, 1977. Hasil absorbansi dengan Spektrofotometer Serapan Atom menunjukkan
adanya absorbansi pada panjang gelombang 283,3 nm untuk timbal dan kadmium 228,8 nm. Hal ini juga membuktikan secara kualitatif bahwa sampel
mengandung ion timbal dan ion kadmium.
4.2 Analisis Kuantitatif 4.2.1 Kurva Kalibrasi Timbal dan Kadmium