Pemerian : serbuk putih sampai praktis putih, tidak berbau, melebur pada suhu 190 °C disertai peruraian.
Kelarutan : tidak larut dalam air, mudah larut dalam aseton dan kloroform, larut dalam etanol serta sukar larut dalam benzen dan eter.
Betametason adalah obat kortikosteroid yang mengandung fluor, mempunyai daya kerja yang besar. Akan tetapi penggunaan obat kortikosteroid
yang mengandung fluor dalam jangka waktu lama, dapat menyebabkan pelebaran kapiler dan pembuluh nadi halus yang bersifat permanen sampai terjadi atropi
kulit. Betametason dalam bentuk krim biasanya merupakan senyawa Betametason
Valerat. Indikasi dari krim ini adalah alergi dan peradangan lokal. Pengobatan dilakukan dengan mengoleskan tipis pada kulit 2 – 3 kali sehari Sartono, 1996.
2.4 Kromatografi
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh ahli botani Rusia pada tahun 1903 yang bernama Michael Tswett untuk memisahkan pigmen warna
dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat. Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan
yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis kuantitatif dalam bidang farmasi, industri dan lain sebagainya. Kromatografi
merupakan suatu teknuk pemisahan yang menggunakan fase diam stationary phase dan fase gerak mobile phase Rohman dan Gandjar, 2007.
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewai suatu
kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase
gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase
gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel Rohman dan Gandjar, 2007.
2.4.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga dengan HPLC High Performance Liquid Chromatografi dikembangkan pada akhir tahun
1960-an. KCKT merupakan metode yang dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan
kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa
aktif obat, produk–produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel- sampel yang berasal dari lingkungan; memurnikan senyawa dalam suatu
campuran; kontrol kualitas; dan mengikuti jalannya reaksi sintestis Rohman, 2007.
Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT mempunyai beberapa keuntungan bila dibandingkan dengan sistem pemisahan lain, diantaranya :
1. Proses cepat, untuk analisis yang tidak rumit, dapat dicapai waktu analisis
kurang dari 5 menit. 2.
Daya pisahnya baik, kemampuan linarut berinteraksi secara selektif dengan fase diam dan fase gerak memberikan parameter tambahan untuk mencapai
pemisahan yang dikehendaki.
3. Detektor yang peka dan unik, detektor yang digunakan adalah UV 254 nm
yang dapat mendeteksi berbagai jenis senyawa dalam jumlah nanogram. 4.
Kolom dapat dipakai kembali, tetapi mutunya menurun. Laju penurunan mutu tergantung pada jenis cuplikan yang disuntikan, kemurnian pelarut, dan jenis
pelarut yang dipakai. 5.
Ideal untuk molekul besar dan ion. 6.
Mudah memperoleh kembali cuplikan karena detektor tidak merusak cuplikan. Pelarut dapat dihilangkan dengan penguapan Johnson dan
Stevenson, 1991.
2.4.2 Proses Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Metode kromatografi cair kinerja tinggi diperkenalkannya pompa bertekanan tinggi dan perkembangan detektor yang sangat peka telah
membangkitkan perhatian pada kromatografi kolom, yang semula menjadi kurang penting dan kurang menguntungkan sebagai akibat penggunaan lapis tipis. Bidang
baru dalam kromatografi kolom adalah kromatografi cair kinerja tinggi KCKT = HPLC = High Performance Liquid Chromatography, yang ada dasarnya
perbaikan dalam laju aliran, karena pada kromatografi kolom klasik laju aliran sangat rendah. Aliran dapat dipercepat hingga 1 ml permenit dengan
menggunakan tekanan tinggi Sardjoko, 1993. Kromatografi cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 254 nm atau
bila digunakan detektor yang didapat diatur panjang gelombangnya, pengukuran dapat dilakukan pada panjang gelombang serapan maksimum lebih kurang 240
nm. Kolom 4 mm x 30 cm berisi bahan pengisi dan pompa yang dapat dijalankan
pada tekanan kolom hingga 3500 psi. Perbandingan luas puncak terkecil dan terbesar, R
s
pada tiga kali penyuntikan ulang larutan baku tidak lebih dari 2,0. Tetapkan perbandingan tinggi puncak pada waktu retensi yang sama dari larutan
uji dan larutan baku Dirjen POM, 1995.
2.5 Instrumen KCKT
Instrumen KCKT tersusun atas 6 bagian dasar, yaitu wadah fase gerak resrvoir, pompa pump, tempat injeksi sampel injektor, kolom column,
detektor detector dan perekam recorder. Ilustrasi instrument KCKT dapat dilihat pada Gambar berikut:
Gambar 2.2 Instrument Dasar KCKT De Lux Putra, 2007.
2.5.1 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu laboraturium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya
dapat menampung fase gerak dimana antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan degassing penghilan gas yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama
dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis Rohman dan Gandjar, 2007.
2.5.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, dan teflon. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 0,1-3 mlmenit Roman dan Gandjar, 2007.
2.5.3 Injektor
Pada waktu sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya ke dalam kolom on column injecktion atau
digunakan katup injeksi. Katup putaran loop valve, tipe injektor ini umumnya digunakan dengan cara otomatis dengan adaptor khusus, volume-volume lebih
kecil dapat diinjeksikan secara manual. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke kolom Meyer, 2004.
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom kepala kolom, diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada tiga
jenis dasa injektor, yaitu: a. Aliran henti; b. Septum; c. Katup jalan kitar Johnson, 1991.
2.5.4 Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.
Kolom dapa dibagi menjadi dua kelompok: a.
Kolom analitik : diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom
tergantung pada jenis kemasan. b.
Kolom preparatif : umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25-100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada komputer kamar, tetapi juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama
untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi ekslusi Rohman dan Gandjar, 2007.
Kolom kromotografi untuk pengaliran oleh gaya tarik bumi gravitasi atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis
tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Salah satu konsep penting KCKT ialah mengusahakan volum pelarut antara penjerap dan detektor
atau fraksinator sekecil mungkin untuk mencegah pencampuran kembali fraksi- fraksi setelah terpisah Gritter, 1991.
2.5.5 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan noise yang rendah, dan memberi tanggapanrespon untuk semua tipe senyawa Johnson dan Stevenson, 1991.
Detektor paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kinerja tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam detektor
dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas.
Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan Johnson dan Stevenson, 1991.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: • Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
• Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil
• Stabil dalam pengoperasiaannya • Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8 �� atau
lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya bervolume 1 �� atau lebih
kecil lagi • Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan dengan konsentrasi solut
pada kisaran yang luas kisaran dinamis linier • Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
Rohman, 2007.
2.5.6 Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak- puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram Johnson dan
Steven, 1991.
Guna kromatogram : 1.
Kualitatif : waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif : luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan
dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi Johnson dan Stevenson, 1991.
2.6 Fase Gerak
Fase gerak pada eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal fase diam lebih
polar daripada fase gerak, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik fase diam kurang polar daripada
fase gerak, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut Rohman, 2007.
Dalam kromatografi Cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase
gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak.
Fase gerak harus : • Murni, tidak ada pencemarkontaminan
• Tidak bereaksi dengan pengemas • Sesuai dengan detektor
• Melarutkan cuplikan • Mempunyai viskositas rendah
• Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas Gelembung udara yang ada harus dihilangkan dari pelarut, karena udara
yang keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan Munson, 1981.
2.7 Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya gugus silanol Si-OH Rohman, 2007.
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen- reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol
dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsianol yang lain Rohman, 2007. Oktadesil silika ODS atau C
18
merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil nitril lebih
cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi yang disebabkan
karena adanya kandungan air yang digunakan Rohman, 2007.
BAB III METODE PENGUJIAN
3.1 Tempat Pelaksanaan Penetapan kadar
Penetapan kadar ini dilakukan di ruang Laboratorium yang terdapat di Industi PT. Kimia Farma Persero Tbk. Plant Medan yang beralamat di Jl.
Sisingamangaraja Km. 9 No. 59 Medan.
3.2 Alat
Alat-alat yang digunakan adalah batang pengaduk, beaker glass pyrex, botol vial, maat pipet, membran filter Phenex NY 0,45 µm, labu tentukur
pyrex, neraca analitik digital semi mikro balance, unit peralatan kromatografi cair kinerja tinggi Waters yang terdiri dari detektor UVVis merk Waters 2489,
kolom bondapack C18 3,9 x 300 mm, penyuntik mikroliter 100 µl, pompa merk Waters 1525, spuit 10 ml, ultrasonic, wadah fase gerak.
3.3 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah akuabides, akuadem bebas CO
2,
asetonitril, metanol, krim betason n, bethametason valerat BPFI.
3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi
3.4.1 Pelarut
Pelarut dibuat dengan menggunakan larutan metanol : asam asetat glacial dibuat dengan cara mencampurkan larutan tersebut dengan perbandingan 1000:1
dalam 1 L.
