3.6.4.3. Morfologi sperma
Untuk menentukan morfologi sperma, diambil sperma dari cauda epididimis tersebut di atas dan dibuat sediaan hapus pada kaca objek, dikeringkan. Kemudian
diberi alkohol 70 selama 15 menit, dikeringkan dan diberi perwarnaan Giemsa selama 15 menit. Setelah itu dibilas dengan air kran dan dikeringkan. Kemudian
dengan mikroskop cahaya dihitung dengan jumlah 100 sperma, ditentukan persentasi sperma yang normal dan abnormal. Untuk mendapatkan hasil akhirnya,
jumlah persentase sperma yang normal kiri dan kanan cauda epididimis dijumlah
kemudian diambil rata-ratanya.
3.6.4.4. Motilitas sperma
Suspensi sperma yang diperoleh biarkan terlebih dahulu selama 5 menit pada suhu kamar selanjutnya teteskan suspensi ini pada kamar hitung Improved
Neubauer amati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran lensa objektif 40 kali. Periksa 4 – 6 lapangan pandang untuk mendapat 100 sperma secara
berurutan yang kemudian diklasifikasi sehingga menghasilkan persentase setiap kategori motilitas.
3.6.4.5. Pemeriksaan kadar MDA
Pemeriksaan kadar MDA testis mencit dilakukan pada hari ke-36 setelah perlakuan pada semua kelompok. Testis dihomogenkan dalam 5 ml larutan buffer
phosphate pH 7,2. Metode pemeriksaan MDA yang telah dimodifikasi sebagai berikut Hsieh et al., 2006, Fauzi, 2008 :
Universitas Sumatera Utara
a Reagensia : 1 2-Thiobarbituric acid Merck; Cat. No. 1.08180.0025
2 1,1,3,3-Tetramethoxypropane 99 Sigma; Cat. No. 108383 500 µM 3 Acetic acid glacial
4 Sodium hydroxide NaOH 5 Aquadest
b Persiapan Regensia 1. TBABuffer Reagent
TBABuffer Reagent terdiri dari : 0,67 g 2-thiobarbituric acid dilarutkan dalam 100 mL aquadest, selanjutnya 0,5 g sodium hydroxide dan 100 mL asam asetat
glacial. 2. Standard MDA
Sebanyak 250 µL 1,1,3,3-tetramethoxypropane Malondialdehyde bis 500 µM dilarutkan dalam 750 µL aquadest untuk memperoleh larutan stok MDA 125 µM.
Selanjutnya dari larutan stok MDA 125 µM dilarutkan dalam aquadest dan dibuat 8 seri standar yang dapat dilihat pada tabel di bawah ini :
Tabel 1. Persiapan Standar MDA untuk Spektrofotometri Nomor
standard Konsentrasi
MDA µM
Volume MDA
standard µL
Volume pelarut
µL 8 50 400 600
7 25 200 800 6 10 80 920
5 5 40 960 4 2,5 20 980
3 1,25 10 990 2 0,625 5 995
1 0 0 1000
Universitas Sumatera Utara
c Prosedur uji 1 Sebanyak 500 µl sampel atau standar MDA dimasukkan dalam tabung
ependorf yang masing-masing telah diberi label. 2 Ditambahkan 0,5 ml aquadest pada masing-masing tabung.
3 Kemudian ditambahkan 0,5 ml TBABuffer Reagent. 4 Selanjutnya masing-masing tabung diinkubasi di dalam waterbath dengan
suhu 95 C selama 60 menit.
5 Setelah diinkubasi, masing-masing tabung dikeluarkan dari waterbath dan setelah dingin masing-masing tabung disentrifugasi dengan kecepatan
7000 rpm selama 10 menit. 6 Supernatan diambil untuk selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 534 nm.
3.7. Analisa Data dan Pengujian Hipotesis
Kategori